[发明专利]无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统及双表达PPRV H/F蛋白疫苗的构建

摘要

本发明公开了一种无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统及双表达PPRV H/F蛋白疫苗的构建，该重组系统不但可以构建单表达、双表达的重组病毒或重组疫苗，甚至可以构建表达三个蛋白以上的重组病毒或重组疫苗，由该重组系统获得的重组病毒，不需要任何筛选标签，避免了筛选标签对疫苗使用中存在的一些潜在不利影响。此外，本发明还公开了通过该重组系统制备的双表达小反刍兽疫病毒H和F蛋白且无筛选标签的重组山羊痘病毒，研究结果表明，该重组病毒能够诱导比单抗原表达更全面的细胞和体液免疫，能够同时预防PPR和羊痘两种重大疫病，且诱导的足够高的中和抗体有利于免疫血清学监测，因此在预防及治疗小反刍兽疫和山羊痘方面将具有良好的应用前景。

主权项

一种无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统，其特征在于包括：(1)重组山羊痘病毒：所述的重组山羊痘病毒的TK基因中依次插入有ApaI酶切位点、eGFP基因、IRES序列、gpt基因、p11启动子序列、p7.5启动子序列以及NotI酶切位点，命名为rGPV‑NA；(2)用于插入外源基因的双表达质粒载体：所述的双表达载体按照以下方法构建得到：以TK‑f和TK‑r为引物，以提取的GPV基因组为模板，扩增TK基因，并克隆至Xho I和EcoRI双酶切的Psp72质粒，命名为Psp72‑TK；以P7.5‑4‑f和P7.5‑4‑r为引物、质粒pTK‑gpt‑ires‑eGFP为模板PCR扩增P7.5启动子片段，命名为P7.5‑4；同时以pSP72‑TK‑f和pSP72‑TK‑r为引物，以pSP72‑TK质粒为模板，PCR扩增出pSP72‑TK片段；将pSP72‑TK片段和P7.5‑4片段分别用NheI和SacI双酶切并连接，获得质粒pSP72‑TK‑P7.5‑4；以P7.5‑interval‑f和P7.5‑interval‑r为引物，以PPRV基因组全长cDNA克隆为模板，扩增用于隔开两个P7.5启动子的间隔序列P7.5‑interval；以p7.5‑5‑f和p7.5‑5‑r为引物，质粒pTK‑gpt‑ires‑eGFP为模板，PCR扩增P7.5启动子片段，命名为P7.5‑5；以pSP72‑TK‑P7.5‑4‑f和pSP72‑TK‑P7.5‑4‑r为引物，以质粒pSP72‑TK‑P7.5‑4为模板，PCR扩增出pSP72‑TK‑P7.5‑4片段；采用一步克隆法试剂盒将以上P7.5‑interval、P7.5‑5和pSP72‑TK‑P7.5‑4连接到一起，获得用于插入外源基因的双表达质粒载体，命名为pTK‑P7.5‑4‑5‑double质粒；(3)用于病毒重组的宿主细胞。