[发明专利]表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌及其构建方法与应用

摘要

本发明涉及表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌及其构建方法与应用。主要包括构建基于冰核蛋白的表面展示谷氨酸脱羧酶的重组工程菌，将谷氨酸脱羧酶重组工程菌接种到培养基中振荡培养，加入IPTG或乳糖诱导谷氨酸脱羧酶的表达，收集的表面展示谷氨酸脱羧酶的重组菌，并用于底物谷氨酸脱羧制备γ‑氨基丁酸。本发明避免了常规表达胞内酶的全菌体转化中需要进行透性化处理的过程，因重组酶展示表达在重组菌表面，底物不需进入菌体细胞就可与重组酶接触完成转化，达到提高重组菌体表观活力的目的。本发明的方法简便、成本低、易于操作，可高效提高菌体的谷氨酸脱羧酶的表观活力。

主权项

1.一种表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌的构建方法和扩大培养方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1）将展示基元编码基因和谷氨酸脱羧酶编码基因融合串联，连接到表达载体上，构建、筛选重组表达载体，再将重组表达载体导入宿主细胞获得表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌；/n所述的展示基元选自冰核蛋白的N段171个氨基酸，所述冰核蛋白的氨基酸的编码基因序列见GenBank:EU360731.1；/n所述的谷氨酸脱羧酶编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；/n所述的表达载体为pET28a；/n所述的构建、筛选重组表达载体的具体方法为：/n根据谷氨酸脱羧酶编码基因序列，以及冰核蛋白的展示基元的编码序列设计引物，PCR扩增目的基因，用限制性内切酶双酶切两种目的基因，或通过重叠PCR将两种目的基因连接到一起并酶切，与相应酶切的载体连接，转化，抽提质粒，PCR或酶切鉴定阳性重组子，测序验证阳性重组子；/n所述的宿主细胞为大肠杆菌；/n2)将获得的表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌接种到培养基中振荡培养，获得种子液；/n3)将种子液转接到新的培养基中，振荡培养到OD600＝0.6-0.8时，加入诱导剂诱导谷氨酸脱羧酶的表达，收集得到表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌；/n所述引物包括inp-F和inp171-R；/n所述inp-F：5’-ggatccatgGATCTCGACAAGGCGT-3’；/n所述inp171-R：5’-gaattcggatccGGTCTGCAAATTCTGC-3’。/n