[发明专利]基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法

摘要

本发明公开了一种基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，属于生物工程技术领域。其包括以下步骤收集桔小实蝇触角总RNA；通过RT‑PCR获得桔小实蝇气味结合蛋白的全长；构建桔小实蝇气味结合蛋白的原核表达载体；通过IPTG诱导桔小实蝇重组气味结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；通过竞争性荧光结合方法获得桔小实蝇重组气味结合蛋白与寄主水果气味挥发物的结合反应谱，解离常数KD低于10μmol/L寄主水果嗅觉以下，荧光竞争的IC50值小于30μmol/L时，确定为适合桔小实蝇的寄主水果嗅觉引诱剂。本发明为桔小实蝇寄主水果嗅觉气味信息引诱剂配方的筛选和设计提供了新的策略。

主权项

基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）收集桔小实蝇触角总RNA；2）通过RT‑PCR获得桔小实蝇气味结合蛋白的全长；3）构建桔小实蝇气味结合蛋白的原核表达载体；4）通过IPTG诱导桔小实蝇重组气味结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化，所述的IPTG诱导桔小实蝇重组气味结合蛋白表达的诱导条件为：IPTG浓度为0.8～1.2mmol/L，温度为28～32℃，诱导转速为150～250rpm，诱导时间为4～6h；5）通过竞争性荧光结合方法获得桔小实蝇重组气味结合蛋白与寄主水果气味挥发物的结合反应谱，确定为适合桔小实蝇的寄主水果寄主水果嗅觉嗅觉引诱剂，具体工艺步骤包括：a）荧光配基1‑NPN与桔小实蝇重组气味结合蛋白的结合在282nm激发波长下，向1μmol/L的桔小实蝇重组气味结合蛋白中逐次加入1mmol/L的1‑NPN，充分混匀；b）配基结合和EAG验证选取桔小实蝇寄主水果主要气味挥发物和1‑NPN进行竞争结合桔小实蝇重组气味结合蛋白，如果桔小实蝇寄主水果主要气味挥发物、1‑NPN与BdorOBP相对荧光值竞争至50% 以下，并且解离常数KD低于10μmol/L寄主水果嗅觉以下，荧光竞争的IC50值小于30μmol/L时或者荧光值竞争至30%以下时，则确定为适合桔小实蝇的寄主水果寄主水果嗅觉嗅觉引诱剂。