[发明专利]一种重组CHOK1细胞株的构建方法及其应用在审
| 申请号： | 201710172903.1 | 申请日： | 2017-03-22 |
| 公开（公告）号： | CN106987559A | 公开（公告）日： | 2017-07-28 |
| 发明（设计）人： | 韩阳;张朗;张肖肖;董烨平;董慧芳;蔡洁行;周伟昌;陈智胜 | 申请（专利权）人： | 上海药明生物技术有限公司;无锡药明康德生物技术股份有限公司;苏州药明康德检测检验有限责任公司 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/85;C12N15/38 |
| 代理公司： | 上海浦一知识产权代理有限公司31211 | 代理人： | 戴广志 |
| 地址： | 200131 上海*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | 本发明公开一种能够稳定表达截短型EBNA1蛋白的重组CHOK1细胞株的构建方法，包括以下步骤(1)EBNA1t表达载体的构建，将如SEQ ID NO1所示序列克隆至pWX1.0和pWX2.0载体中；(2)转染与细胞群筛选；(3)有限稀释法克隆，挑选单克隆细胞株。本发明还公开上述方法获得的重组CHOK1‑EBNA1t细胞株用于重组蛋白瞬时表达的应用，包括以下步骤(1)构建重组蛋白瞬时表达载体；(2)转染前进行细胞传代培养；(3)转染与细胞培养工艺，使用PEI将步骤(1)得到的重组蛋白瞬时表达载体转染步骤(2)传代培养获得的CHOK1‑EBNA1t细胞株；(4)评估重组蛋白的表达量。本发明的重组CHOK1‑EBNA1t细胞株用于重组蛋白瞬时表达，不仅表达量高，一般为100‑300mg/L，而且工艺简便，既适用于大体积生产，也适用于小体积高通量筛选。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 重组 chok1 细胞株 构建 方法 及其 应用 | ||
【主权项】：
一种能够稳定表达截短型EBNA1蛋白的重组CHOK1细胞株的构建方法，包括以下步骤：(1)EBNA1t表达载体的构建定义截短型EBNA1蛋白为EBNA1t；将如SEQ ID NO:1所示序列克隆至pWX1.0和pWX2.0载体中，得到pWX1.0‑Z‑EBNA1t和pWX2.0‑B‑EBNA1t；(2)转染与细胞群筛选使用阳离子脂质体将pWX1.0‑Z‑EBNA1t和pWX2.0‑B‑EBNA1t共转染CHOK1宿主细胞；转染后48小时，将细胞接种到96孔板中培养，使用含有抗生素Blasticidin和Zeocin的CD CHO培养基筛选；筛选2‑3周后，将96孔板中存活下来的细胞分别扩增，得到若干细胞群；将目标单克隆抗体的瞬时表达载体，使用PEI转染至各细胞群中，10天后收获细胞培养上清，评估目标单克隆抗体的表达量，挑选出目标单克隆抗体表达量最高的细胞群用于后续有限稀释法克隆；(3)有限稀释法克隆通过有限稀释法从细胞群中分离到单克隆；挑选出目标单克隆抗体表达量最高的CHOK1‑EBNA1t单克隆细胞株。
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