[发明专利]一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法

摘要

本发明公开了一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法。本发明方法包含三部分，第一部分引物的产生，发卡探针I被靶标miRNA打开后，被核酸外切酶I降解单链部分，而后核糖核酸酶H降解DNA：RNA杂合链中的RNA，留下一段短链DNA；第二部分是树状滚环扩增，上一步产生的单链DNA连接长单链DNA探针成环作为模板，然后以该单链DNA为引物进行一级滚环扩增，在滚环扩增体系中引入的发卡茎环结构II，被一级滚环扩增产物打开，从而多级树枝状滚环扩增；第三部分是根据滚环扩增产物中含有的G‑四链体进行检测。本发明是一种灵敏、经济、方便、原位的可视化检测miRNA的方法。

主权项

一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法，其特征在于：包含三部分，第一部分引物的产生，发卡探针I被靶标miRNA打开后，被核酸外切酶I降解凸出的单链部分，而后核糖核酸酶H降解DNA：RNA杂合链中的RNA，留下一段短链DNA；第二部分是树状滚环扩增，上一步产生的单链DNA连接磷酸化的长单链DNA探针成环作为模板，然后以该单链DNA为引物进行一级滚环扩增，在滚环扩增体系中引入的发卡茎环结构II，被一级滚环扩增产物打开，从而引发多级树枝状滚环扩增；第三部分是根据滚环扩增产物中含有的G‑四链体进行定性或定量检测；上述发卡探针I、磷酸化的长单链DNA探针、发卡探针II的设计原则如下：将靶标miRNA分成序列长度接近或相等的两部分，N1、N2，即靶标miRNA序列N1‑N2；发卡探针I包含A、B、C、D四部分，其结构为A‑B‑C‑D，A、D为茎末端区可互补配对、B、C为loop环区；Loop环中的B序列的组成为N2’‑N1’，分别与N2、N1互补配对；C是一小段单链序列；磷酸化的长单链DNA探针包含E、F、G、H四部分，其结构为E‑F‑G‑H；E为5’末端磷酸化序列，与N2序列相同；H为3’末端序列，与N1相同；F长度为20‑25个碱基；G为G‑四链体的互补序列；发卡探针II包含I、J、K、L四部分，其结构为I‑J‑K‑L，I和L为茎末端区可互补配对，J、K为Loop环区；其中，J与上述磷酸化的长单链DNA探针的F序列相同，K‑L与发卡探针I的B序列相同。