[发明专利]藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法

摘要

本发明公开了一种藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法，选用CHAPS作为表面活性剂，蛋白酶抑制剂选用蛋白酶抑制剂混合物，DTT作为还原剂，并将DTT的浓度由65 mmol/L增至100 mmol/L，另外，增加70 mmol/L Tris，以为二硫键的还原提供适宜的环境，抑制某些蛋白酶的活性和增加某些蛋白质的溶解度。该方法获得的绵羊卵巢全蛋白质含量、斑点数高于其他方法，凝胶图谱的匹配率和分辨率较高，矩形区域和椭圆形区域内蛋白质斑点数均较多，符合绵羊卵巢蛋白质提取的要求。本发明结合人类及模式动物卵巢提取方法，筛选出直接裂解法对绵羊卵巢全蛋白进行提取，从而获得最适的藏系绵羊卵巢全蛋白的提取方法，对研究藏系绵羊起到极大的促进作用。

主权项

一种藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法，其特征在于：取刚宰杀的成年健康经产藏母羊的卵巢，并用PBS缓冲液冲洗干净表面血液和杂质，放入冻存管中，并置于‑80℃低温下保存备用；采用直接裂解法提取卵巢全蛋白，按以下步骤进行，1）、将卵巢组织用液氮预冷的砸碎器砸碎，将砸碎的粉末用研钵在液氮环境中研磨成粉末；2）、样品粉末按照1:10（w/v）加入裂解液，涡旋振荡2min；裂解液I配方：7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS（w/v），0.5% 两性电解质pH 3‑10（v/v），65 mmol/L DTT（w/v），10μL/mL PMSF；在裂解液I配方基础上，结合人及模式动物卵巢全蛋白提取方法，根据绵羊卵巢组成成分及含量特点，对裂解液配方进行改进，配制裂解液II配方和裂解液III配方，对直接裂解法配方进行优化研究；裂解液II配方：8M尿素，2M硫脲，2% CHAPS（w/v），2% Triton X‑100（v/v），0.5% 两性电解质 pH 3‑10（v/v），65 mmol/L DTT（w/v），10μL/mL 蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）；裂解液III配方：8M尿素，2M硫脲，4% CHAPS（w/v），0.25% 两性电解质 pH 3‑10（v/v），100 mmol/L DTT（w/v），70 mmol/L Tris，10μL/mL 蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）；3）、4℃静置30min；4）、样品放在装有冰水混合物的烧杯里超声，22%振幅；样品置于4℃下裂解2h；5）、样品在4℃，14000r/min离心1h，取上清；6）、采用2‑D clean（Bio‑Rad）试剂盒进行样品处理；7）、Bradford蛋白定量测量出蛋白浓度后，按照用途不同，分装与保存在‑80℃冰箱中备用。