[发明专利]一种优化的、高效率的农杆菌介导的花生转化方法

摘要

本发明涉及一种优化的、高效率的农杆菌介导的花生转化方法。本方法优化了花生再生芽的生成途径，省略了传统农杆菌侵染前的预培养过程，大大缩短了获得再生转化植株的周期。在侵染过程中通过烟草提取物的添加及对花生外植体的超声波处理提高了花生的分化率及转化率。通过在培养基中添加玉米素ZT及自由基清除剂有效地促进花生外植体的细胞分裂及抗性芽分化，降低了外源激素对植物细胞的影响，减少了继代培养的次数，同时有效地减轻了花生外植体的褐化现象。本发明只需常规的菌株培养，无需基因枪、金粉等昂贵的实验耗材。操作简便易行，实验周期短，转化率高，在不同基因型花生品种间转化效果稳定。

主权项

1.一种农杆菌介导的花生转化方法，其特征在于：包括以下操作步骤：/n(1)活化、重悬待转化的重组农杆菌菌液，调整OD₆₀₀值为0.5～0.8；用酒精、升汞依次处理花生子叶外植体；用无菌水冲洗干净后浸泡2.5h；纵切后将子叶胚芽节点处切除得到待转化外植体；/n(2)用加有烟草提取物的农杆菌菌液侵染步骤(1)获得的外植体5～15min，侵染同时进行超声波处理2～8min，去除多余的菌液后，将其置入共培养基中，26℃条件下暗培养2～4d；/n(3)共培养后，将外植体取出用含100～300mg/L Cef和300～500mg/L Carb的无菌水冲洗4～5遍后，用灭菌滤纸吸干，接到含100～300mg/L Cef和300～500mg/L Carb的抗性芽诱导培养基上，在26℃、16h光照条件下选择培养14d；当有绿色芽点形成后，去除子叶，在诱导培养基上每两周继代一次；/n(4)当绿色芽点生长到1～2cm后，接种到分化培养基上促进芽分化及伸长，随着芽丛的继续生长，将其切分成小块，每两周继代一次，继续分化培养；/n(5)当诱芽长至3～4cm高并有3～4片小叶时，将诱芽切下，转接到生根培养基诱导生根，待幼苗根系发育完全，洗净根上的培养基，移栽到含灭菌沙土的花盆中；每个月用Hoagland营养液浇一次，同时每十天用自来水浇灌一次；/n所述共培养基为改良的MS培养基，其中添加1～2mg/L ZT、4～8mg/L 6-BA、0.1～0.5g/L酪蛋白水解物、0.05～0.15g/L肌醇，pH值为5.2；/n所述抗性芽诱导培养基为改良的MS培养基，其中添加1～2mg/L ZT、4～8mg/L 6-BA、0.1～0.5g/L酪蛋白水解物、2～4g/L L-脯氨酸、0.05～0.15g/L肌醇、0.1～0.3mmol/L维生素C、0.1～0.4mmol/L GSH、0.02～0.1mmol/L维生素E，pH值为5.8；/n所述分化培养基为改良的MS培养基，其中添加100～300mg/L Cef、300～500mg/LCarb、1～2mg/L ZT、1～2mg/L NAA、1～3mg/L KT、1～4g/L酪蛋白水解物、0.05～0.15g/L肌醇、20～40g/L山梨醇、0.1～0.3mmol/L维生素C、0.1～0.4mmol/L GSH、0.02～0.1mmol/L维生素E，pH值为5.8。/n