[发明专利]一种能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅育种方法

摘要

本发明公开了一种能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅育种方法，它是在大鳞副泥鳅TYR基因序列上设计TYR基因靶位点，然后设计上游引物及与其匹配的下游引物，以骨架质粒为模版进行PCR扩增，体外转录、纯化后得到gRNA；以线性化Cas9质粒为模版，体外转录、纯化后得到Cas9mRNA；对大鳞副泥鳅受精卵显微注射，之后将受精卵进行孵化培育，并对基因敲除鱼进行杂交，获得能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅。

主权项

1.一种能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅育种方法，其特征在于包括以下步骤：1)在大鳞副泥鳅TYR基因序列上，按照CRISPR/Cas敲除原理，设计TYR基因靶位点，所述大鳞副泥鳅TYR基因序列如SEQ ID NO：1所示；2)设计含有TYR基因靶位点序列的上游引物及与其匹配的下游引物，以骨架质粒为模版进行PCR扩增，体外转录、纯化后得到gRNA；3)以线性化Cas9质粒为模版，体外转录、纯化后得到Cas9mRNA；4)对大鳞副泥鳅受精卵显微注射gRNA和Cas9mRNA，注射部位为动物极，之后将受精卵进行孵化培育；5)受精卵孵化后，挑选体色素出现异常的基因敲除鱼，进行杂交，获得的F1代中无体色素出现的个体，即为能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅；所述TYR基因靶位点序列如SEQ ID NO：2所示；所述上游引物序列如SEQ ID NO：3所示，所述下游引物序列如SEQ ID NO：4所示；所述gRNA和Cas9mRNA的注射浓度和剂量为：Cas9mRNA的浓度为500ng/μL，gRNA的浓度为30ng/μL，注射的剂量为2nL。