[发明专利]一种采用毕赤酵母制备白藜芦醇二聚体的方法

摘要

本发明公开了一种采用毕赤酵母制备白藜芦醇二聚体的方法，主要包括步骤构建含4‑羟基芪过氧化物酶基因的pPU19质粒载体、将重组质粒表达载体pPU19‑4TTS转入Komagataella pastoris DSMZ 70382毕赤酵母菌株中获得表达4‑羟基芪过氧化物酶的毕赤酵母、制备含白藜芦醇二聚体的发酵产物和分离白藜芦醇二聚体。本发明首次应用毕赤酵母，通过基因工程法将能够产生白藜芦醇二聚体的关键性4‑羟基芪过氧化物酶基因导入毕赤酵母，筛选获得一种高通量表达4‑羟基芪过氧化物酶毕赤酵母菌种。经过微生物发酵法制备白藜芦醇二聚体，经本发明方法分离得到的白藜芦醇二聚体纯度为45‑60％，其中白藜芦醇转化白藜芦醇二聚体的转化率为35％‑45％。

主权项

一种采用毕赤酵母制备白藜芦醇二聚体的方法，其特征在于包括如下步骤：1)含4‑羟基芪过氧化物酶基因的pPU19质粒载体的构建：分别应用限制性内切酶EcoP1和EcoP15酶切4‑羟基芪过氧化物酶基因片段和pPU19质粒，得到酶切后的4‑羟基芪过氧化物酶基因片段4TTS(+)和pPU19质粒基因片段pPU19(+)；采用T4连接酶将上述酶切产物进行连接，得到重组质粒pPU19‑4TTS，然后通过PCR技术扩增以pPU19质粒DNA为PCR扩增模板的4‑羟基芪过氧化物酶基因，得PCR扩增后的重组质粒表达载体pPU19‑4TTS；所述4‑羟基芪过氧化物酶基因片段4TTS(+)的基因序列为：GAAGAGCTGTCGACAGTCGCATGCCAGCTAAATTAAGAAAACCTTCACTTGCTTCAAGTAAAGCATGTCGATCCTTCAACGAATTCTATATCACTTGGATGGAAAACTAAGTGTTCAGTATTTCACAGGTGACAAACCAGACAAGAAGCGTACATTCATTTGACCGAAGAAGCTTGAGGAGCACCCAAACATGGTGCTTATATGGCTCCATCTCTTAACACGCCAAGAGATCAC；2)通过热激法将PCR扩增后的重组质粒表达载体pPU19‑4TTS转入保藏编号为638632的Komagataella pastoris DSMZ 70382毕赤酵母菌株中，获得表达4‑羟基芪过氧化物酶的毕赤酵母，命名为Pichia pastoris/pPU19/4TTS，其核苷酸序列：TCGCTGGTAATCCCGGCTTTTGCTGCTTACAAGCTTTACGGATTATTTCTAGGAGGTAGNCAATTATTGGGTGGTCGCAGCAGTTTCAAAGAGGAGGAGCCAGCTTCTGGGTCAAAAGAAAAGGGACAGAGCAAGAGACAACAGAAACTAGAAAAGAGAGGACAAAAGGTGAGATACAGATAGAATCTTTGCGAGTGAACCAAGGTAGCTGAAAAACATAACTTGCAAGGATGCTATTGGACAATTTTAGGTGATAAACTCGATTGCTATCACTGGGCTCTGCCACATGGAAGCTTTAGTGAGAAGAGCTGTCGACAGTCGCATGCCAGCTAAATTAAGAAAACCTTCACTTGCTTCAAGTAAAGCATGTCGATCCTTCAACGAATTCTATATCACTTGGATGGAAAACTAAGTGTTCAGTATTTCACAGGTGACAAACCAGACAAGAAGCGTACATTCATTTGACCGAAGAAGCTTGAGGAGCACCCAAACATGGTGCTTATATGGCTCCATCTCTTAACACGCCAAGAGATCACAGCTCTTGCGCACTATTCGAGTCGTTTACTTTTTTTTTGGTTTTTGCTAGGCCTTCCATTACTTCTTTACTTCGTTAGTGACAAGTGACTTAAGGCCAATGTATTCTTGAATCAAAAGAAGGCTGTGTCAATTCCTAAGCCCTACTAGCTCTACTTTCGGAGTGACCTACCGATAAGTTCGCATACGCGAATCTGGACCATTTTTATAATACCAAGTAGAAATTCAATAGCCATCTAGCTGTTTCTACATGATGACAGCCCATAACCATAAAGAAAACTGCAAACGATTGCTGAGCTTGTAGAGCGTCCAGTAAGTAGCGCAATCTCCAGTGAGCAACGTAATATCATATTTTCTTCTCTCTCTTTCATTCTCCTCCGAGAATTACAGAAGCATCATAGTAGTGTACCCACCAATGGTTGTGAGCGACTGCGCGATTCCATGGATGCTACTGAAACCAATGAATGAAACTTGTCAAGTTTCCTCGCTTCCTTTTACATAACGGATCTTTTAACTTAGAAACAGTTTAGTAAAAGAAATTCATCAATACAATGGACGGAGGTAAGTCAGCTCTTTCAGCAAGGGAGCATGGAATCAGATTGGCAACGACTTCTGCGATTCTTATTCTTCCGATTGATTCAACAGTAGATTTGCGAGTGGTTGGCCAAACACACAGTTTCGATGCGATCTCCGTTTGATTTGTATGAATACGCAGTCATCTCATTGGTGGAGCATTTTATACGGATTGATTGAGTGGAAGCATGGTACTGAGAGTATCTACATGTGCATTTCTGTTGGTTGTCCTCGGTTGAGTTTTCGTATCTGTTTGTCCCCCCAATTTTGTCCACTCCTTTTGGCAATCTGCCGAATCCAAGCTCATAATACTAACTCCCATTTTAGAAGACGTTGCAGCAGTAAGTACCCTTACATGTAATCCATGAAAGCAAATGTGGCGCAGTCAATCGAAGTCACTGTCTGATTGATTCTTCCCTCAGTGGCGGT；3)对步骤(2)得到的Pichia pastoris/pPU19/4TTS菌株通过划线和继代培养，经初筛、复筛，进行液培发酵，选取代谢产物含量高或是活性高的菌液划线于固体筛选培养基上，分离纯化，得到复筛菌种；4)制备含白藜芦醇二聚体的发酵产物：配置含有15‑20g/L的白藜芦醇的LB发酵培养基，从平板上挑取Pichia pastoris/pPU19/4TTS单菌落于LB培养基的摇瓶中，发酵，得到含白藜芦醇二聚体的发酵产物；5)白藜芦醇二聚体的分离：将步骤(4)所述含白藜芦醇二聚体的发酵产物液体经树脂纯化，得固型物即为白藜芦醇二聚体提取物。