[发明专利]一种深层液体发酵制备葡萄糖氧化酶酶制剂的方法及应用

摘要

本发明公开了一种深层液体发酵制备葡萄糖氧化酶酶制剂的方法，属于微生物技术领域，包括如下步骤：发酵菌种的活化，制备嗜热拟青霉孢子悬液，一级嗜热拟青霉种子液的制备，葡萄糖氧化酶的搅拌式发酵罐发酵，葡萄糖氧化酶酶液的提纯和浓缩，葡萄糖氧化酶酶液的冷冻干燥；其中，一级嗜热拟青霉种子液的制备，葡萄糖氧化酶的搅拌式发酵罐发酵，葡萄糖氧化酶酶液的提纯和浓缩，葡萄糖氧化酶酶液的冷冻干燥等步骤为创新点所在；各步骤中所用培养基的原料均为农副产品。本发明所提供的生产方法的生产效率高，成本较低，有利于工业化生产；且该生产方法制备的葡萄糖氧化酶具有耐高温、耐酸、酶活性强、酶回收率高等优点。

主权项

一种深层液体发酵制备葡萄糖氧化酶酶制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：A.发酵菌种的活化：将保藏号为CGMCC No.13182的嗜热拟青霉XZPT6在PDA培养基平板上划线活化，而后倒置于40～42℃恒温培养箱中24～48h进行活化培养；B.制备嗜热拟青霉孢子悬液：从步骤A活化好的菌种中用接种环刮取嗜热拟青霉菌丝，转移至嗜热拟青霉孢子培养基上，置于37～40℃生化培养箱内培养，培养至菌丝长出孢子，经两次传代培养恢复其活力，以含有0.01％吐温80的无菌水多次洗涤、收集孢子，制备孢子含量为1.0×108CFU/mL的孢子悬液，备用；C.一级嗜热拟青霉种子液的制备：将步骤B中制备好的嗜热拟青霉孢子悬液按照5～6％v/v的接种量接入装有150～200mL种子培养基的1000mL锥形瓶中，37～42℃摇床培养32～48h，转速160～180r/min；D.葡萄糖氧化酶的搅拌式发酵罐发酵：将8L发酵培养基装入15L的搅拌式发酵罐中，发酵罐夹套升温至95℃，再将蒸汽直接通入发酵培养基中，121℃灭菌30min，将温度逐渐降至40～45℃，将步骤C所得的一级嗜热拟青霉种子液按照5～10％v/v的量接入发酵罐发酵培养基中，发酵罐压为0.05MPa；初始发酵0～48h，发酵控制条件为：37～45℃，发酵培养基初始pH5.5～6.0，初始通气量1.0～1.2L/min，搅拌转速260～280r/min；发酵2～4d，发酵温度降为35～40℃，无菌空气通气量1.5～1.7L/min，同时调整搅拌转速280～350r/min，调整通气量及搅拌转速保证溶解氧不低于35％，pH调节至6.0～6.5；发酵过程中定时补料添加补料培养基；E.葡萄糖氧化酶酶液的提纯和浓缩：发酵结束后，发酵液经4层纱布过滤，去除菌丝，收集滤液，滤液8000r/min、离心20min，弃去杂质等沉淀，保留上清；采用超滤膜超滤，第一次采用截留分子质量为120～150kDa的超滤膜过滤，保留滤出液，第二次用20～30kDa的超滤膜过滤，滤液浓缩3～5倍，保存截留液；粗酶液在50～60℃下旋转蒸发仪抽真空浓缩，进一步将酶液浓缩至原体积的10～20％；F.葡萄糖氧化酶酶液的冷冻干燥：向浓缩后的粗酶液中加入保护剂：2～3wt％的糊精、1～3wt％的可溶性淀粉、0.1～0.2wt％的山梨酸钾；充分搅拌分散后，‑20℃冷冻8～10h，真空度30～40Pa、温度‑35℃下，冷冻15～18h；粉碎，即得到葡萄糖氧化酶酶制剂。