[发明专利]一种基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB1电化学检测方法及应用

摘要

本发明属于农产品质量安全检测技术领域，涉及农产品中AFB₁的检测，具体涉及一种基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB₁电化学检测方法及应用。生物素标记的AFB₁核酸适配体与Block探针形成的杂交复合物预先固定在磁珠表面，在靶标存才情况下，AFB₁与Block探针与适配体竞争结合，被置换下来的Block探针能够触发链置换扩增反应从而产生大量的扩增子。该扩增子能够协同参与丝网印刷电极表面的表面临近杂交反应，从而引入电活性探针产生相应的电信号。通过特异性实验及与传统ELISA方法的对比，结果证明本发明特异性好、灵敏度高、准确可靠，有望为玉米农产品中AFB₁的大规模筛查提供一种技术选择。

主权项

1.一种基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB1电化学检测方法，其特征在于：所述检测方法将AFB1核酸适配体作为分子识别元件，丝网印刷电极作为换能器，采用恒温链置换扩增方法进行信号放大后，再通过表面临近杂交反应进行信号输出；所述AFB1核酸适配体的序列如SEQ ID NO：1所示；包括以下步骤：（1）磁珠的表面修饰：将生物素标记的AFB1核酸适配体和Block探针储备液，分别经95℃ 5min，0℃ 10min的预处理，然后用AFB1 1×BB缓冲液稀释至200nM，并于室温杂交30min，制得杂交混合液；同时，取50 µL磁珠用500 µL AFB1 1×BB缓冲液洗涤两次；取200µL杂交混合液于离心管中加入洗涤过的磁珠，于室温下孵育15min，最后再用500 µL AFB1 1×BB缓冲液，洗涤孵育过的磁珠两次，完成磁珠的表面修饰；（2）丝网印刷电极的预处理及传感界面的制备：在经无水乙醇和去离子水洗涤干净的丝网印刷电极的电极表面上，滴加40 µL 0.1 M H2SO4溶液，在2V直流电压下活化60s，在活化后的丝网印刷电极上，滴加4 µL含有1μM巯基修饰探针的缓冲溶液，在30℃条件下组装3h，用AFB1 1×BB缓冲液清洗组装后的丝网印刷电极，最后滴加4 µL 1mM 6‑巯基己醇溶液于室温中封闭30min，用AFB11×BB缓冲液清洗3次后，将丝网印刷电极吹干于4℃备用；（3）AFB1结合介导的链置换和表面临近杂交反应：在AFB1靶标溶液中加入50µL步骤（1）中修饰好的磁珠，于室温下轻轻震荡孵育30 min，随后磁分离，取10 µL上清，加入10 µL 10×NEB buffer 3.1、2 µL 0.5 μM 链置换探针、2 µL 10 mM dNTPs、4 µL 2 U/µL Vent exo‑聚合酶和2 µL 10 U/ µL Nt.Bst NBI切刻内切酶，用去离子水补充反应体系到100 µL，于55℃下反应1h；接着添加10 µL二茂铁标记探针，混合均匀后，取40 µL滴加到步骤（2）中修饰好的丝网印刷电极表面室温反应30 min，最后用1×AFB1缓冲液洗涤干净并用氮气吹干；（4）电化学检测：向经步骤（3）处理过的丝网印刷电极表面滴加40 µL 含有10 mM MgCl2的0.1 M KClO4溶液，然后进行差示脉冲电化学检测；步骤（1）中Block 探针的序列如SEQ ID NO：2所示，Block 探针储液的浓度为10 µM； AFB1 1×BB缓冲液的配方为：10 mM Hepes, 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 5 mM MgCl2, pH 7.0；所述步骤（2）中巯基修饰探针的序列如SEQ ID NO：3所示，巯基修饰探针的缓冲溶液的配方为：1μM巯基修饰探针、1M NaCl和1mM TCEP；所述步骤（3）中链置换探针的序列如SEQ ID NO：4所示，二茂铁标记探针如SEQ ID NO：5所示。