[发明专利]一种证明缝隙连接在高血压炎症反应中的作用的试验方法

摘要

本发明公开了一种证明缝隙连接在高血压炎症反应中的作用的试验方法，该方法包括以下步骤：细胞培养；流式细胞术：检测CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞内炎症因子IFN‑γ和TNF‑α表达；ELISA检测血清及细胞上清中炎症因子IFN‑γ和TNF‑α表达；CCK‑8检测外周血淋巴细胞增殖反应；MTT检测外周血淋巴细胞增值活化反应。本发明分析原发性高血压患者和非高血压健康者外周血T淋巴细胞、炎症因子的改变与淋巴细胞间缝隙连接通道表达的相关性，阐明缝隙连接在高血压炎症反应中的作用，试验结果均具有统计学意义。

主权项

1.一种证明缝隙连接在高血压炎症反应中的作用的试验方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、细胞培养1.1 淋巴细胞分离将抗凝管内的血液离心，离心2000rpm，5min，上层血清‑20℃保存，上层血清用于后续ELISA检测；剩余血细胞与生理盐水1：1等体积稀释，吹打混匀；取一无菌15ml离心管，加入淋巴细胞分离液，将细胞悬液缓慢按照1：1比例加到淋巴细胞分离液上层，保证细胞悬液置于分离液上层；根据密度梯度离心法分离淋巴细胞，低速离心机水平离心1500rpm，30min，缓升缓降，离心管内由上到下分为4层：血浆层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、红细胞层；将分离的白色浑浊淋巴细胞分离液层吸出至一无菌15ml离心管内，加入3倍生理盐水洗涤，离心1800rpm，6min，洗涤2次，弃上清，沉淀即淋巴细胞；加入1ml培养基重悬，吸取50μl到1.5ml离心管，加450μl PBS稀释10倍，显微镜下计数并用台盼蓝染色观察细胞活性，细胞活性为95％以上，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，将细胞接种在24孔板中；1.2 细胞培养实验步骤将分离出的淋巴细胞计数，调整培养基至细胞浓度为1×10⁶个/ml，将细胞分成不同实验组，给予不同干预措施，阴性空白对照组、Gap27组、ConA刺激活化组、IL‑2刺激活化组，以及Gap27+ConA刺激活化组、Gap27+IL‑2刺激活化组，加入10wt％自体血清，37℃，5％CO2培养箱中培养，在不同时间点收集细胞用于后续流式细胞术检测、CCK‑8检测、和MTT检测；步骤2、流式细胞术：检测CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞内炎症因子IFN‑γ和TNF‑α表达分别收集阴性空白对照组细胞、Gap27组细胞、ConA刺激活化组细胞、IL‑2刺激活化组细胞、Gap27+ConA刺激活化组细胞、Gap27+IL‑2刺激活化组细胞于1.5ml EP管内，每组5×10⁵个培养的淋巴细胞，离心1800rpm，6min，弃上清，100μl PBS重悬细胞，吹打混匀，加入表面抗原PE anti‑human CD4，APC anti‑human CD8a，常温避光孵育30min；加入500μl PBS，离心1800rpm，6min，弃上清；加入125μl固定剂，4℃，孵育20min；加入1ml 1×破膜剂洗涤，离心1800rpm，6min，弃上清，加入100μl 1×破膜剂，所述的100μl 1×破膜剂为2μl抗体+98μl破膜剂，37℃孵育20min；加入1μl FITC二抗，37℃孵育20min；加入1ml 1×破膜剂洗涤，离心1800rpm，6min，弃上清；加入250μl PBS稀释细胞悬液，吹打混匀，流式检测；步骤3、ELISA检测血清及细胞上清中炎症因子IFN‑γ和TNF‑α表达其中，细胞上清来源于阴性空白对照组、Gap27组、ConA刺激活化组、IL‑2刺激活化组，以及Gap27+ConA刺激活化组、Gap27+IL‑2刺激活化组；3.1 ELISA检测炎症因子IFN‑γ和TNF‑α步骤(1)检测前将所有的试剂和样本平衡至室温，室温放置30min；取出微孔板，在每个孔内加入300μl Wash buffer静置浸泡30s；弃掉洗液后，在吸水纸上将微孔板拍干；注意：立即使用微孔板，不要让其干燥；(2)每孔加50μl 1×Assay buffer；(3)将50μl样本以及标准品加入对应的样本孔内，记录所有孔对应的样本；(4)每孔加入50μl检测抗体；封板膜封板，室温孵育2h；(5)弃掉洗液后，在每个孔内加入300μl洗液，按照不同试剂盒的说明书洗板次数不同，注意在吸水纸上将微孔板拍干；(6)在每个孔内加入100μl辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，封板膜封板，室温孵育45min；(7)弃掉孔内的洗液，在每个孔内加入300μl洗液，按照不同试剂盒的说明书洗板次数不同，注意在吸水纸上将微孔板拍干；(8)在每个样本孔内加入100μl TMB，室温避光孵育5‑30min；(9)在每个样本孔内加入100μl终止液，颜色由蓝色变为黄色，充分混匀；在30min内，酶标仪在450nm波长处测定OD值，减去630nm的测定值；(10)根据软件操作说明，拟合标准曲线，求取实验样本的浓度，数据分析；步骤4、CCK‑8检测外周血淋巴细胞增殖反应收集培养的淋巴细胞于15ml离心管中，细胞来源于阴性空白对照组、Gap27组、ConA刺激活化组、IL‑2刺激活化组，以及Gap27+ConA刺激活化组、Gap27+IL‑2刺激活化组，离心1800rpm，6min，收集上清于1.5ml离心管中，置‑20℃保存待测；每组细胞去掉剩余上清后，使用1ml培养基重悬，取细胞悬液100μl，加入96孔一次性无菌细胞培养板中，加入CCK‑8溶液10μl，样本均设3个复孔，另设置空白调零孔置37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育3h，450nm处酶标仪测定吸光度值；步骤5、MTT检测外周血淋巴细胞增殖活化反应收集培养的淋巴细胞于15ml离心管中，离心1800rpm，6min，细胞来源于阴性空白对照组、Gap27组、ConA刺激活化组、IL‑2刺激活化组，以及Gap27+ConA刺激活化组、Gap27+IL‑2刺激活化组，收集上清于1.5ml离心管中，计数，调整培养基至细胞浓度为1×10⁶个/ml，37℃，5％CO₂培养48h，MTT检测淋巴细胞增殖反应；MTT步骤：收集细胞，离心1800rpmn，6min，弃上清，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度为5×10⁵个/ml；将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100μl，因细胞混匀后会继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，设3个复孔，每孔加入10μl 5mg/ml MTT，37℃，5％CO₂培养箱内孵育4h；终止培养，溶解结晶；收集每孔细胞于离心管内，离心1800rpm，6min，弃上清，加入150μl DMSO溶解结晶，待结晶完全溶解后，酶标仪450nm波长检测OD值。