[发明专利]一种三七发状根系制备方法

摘要

本发明涉及一种三七发状根系制备方法，属于医药制备技术领域。本发明三七发状根系制备方法为：(1)在无菌的条件下，将培养出的颗粒状三七愈伤组织轻轻敲碎，形成均匀颗粒，然后在0.5mmol/L CaCl2+0.1g/L活性炭的液体中处理10min，用无菌水冲洗3‑5次，然后再用0.1mmol/L EDTA溶液处理5min，用无菌水冲洗3‑5次，放置在不含任何激素的MS固体培养基上预培养24 h，培养条件为25±1℃，黑暗。预培养后的愈伤组织将用于菌液侵染，获得转化三七愈伤组织。(2)在无菌操作台上，用镊子将预培养后的三七愈伤组织转移到制备好的发根农杆菌的菌液中侵染30 min，90r/min、28℃。

主权项

1.一种三七发状根系制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1) 在无菌的条件下，将培养出的颗粒状三七愈伤组织轻轻敲碎，形成均匀颗粒，然后在0.5mmol/L CaCl2+0.1g/L活性炭的液体中处理10min，用无菌水冲洗3‑5次，然后再用0.1mmol/L EDTA溶液处理5min，用无菌水冲洗3‑5次，放置在不含任何激素的MS 固体培养基上预培养24 h，培养条件为25±1℃，黑暗。预培养后的愈伤组织将用于菌液侵染，获得转化三七愈伤组织。(2) 在无菌操作台上，用镊子将预培养后的三七愈伤组织转移到制备好的发根农杆菌的菌液中侵染 30 min，130 r/min、28 ℃，使预培养的愈伤组织表面的菌液吸干，然后再转接到含有 0、20、40、60、80、100 mg/L 的乙酰丁香酮的 MS 固体培养基中，25±1 ℃，暗培养条件下进行外植体与发根农杆菌之间能够充分的接触；侵染结束后，暗培养 2 d，25±1 ℃； (3)挑取1菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25±1℃振荡培养12h，O.D值为0.3～1.2.取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，培养6h；O.D值为0.3～0.9，3500 rpm下离心5～15min收集菌体； (4)将(3)收集的菌体置于MS液体培养基中并混匀； (5)用(4)混匀后得到的菌液浸染三七愈伤组织10～30min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的三七愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9%琼脂的MS固体培养基中培养1～3d；(6)将(5)共培养后的愈伤组织接入含有500mg/L 头孢噻肟钠的 MS 固体培养基上进行除菌培养，每隔一周就要进行继代培养一次，并逐渐的降低除菌抗生素的浓度直至三七愈伤组织周围的菌斑完全消失；(7) 当诱导出来的毛状根长到 2‑3 cm 左右时，将毛状根剪下，并转移到含有 200 mg/L卡那霉素的 MS 固体培养基上，25±1 ℃，12 h/d 光照条件下进行培养，培养过程中要筛选出具有卡那霉素抗性的生长速度较快、分支较多的即为三七发状根。