[发明专利]一种发根农杆菌转化三七细胞的制备方法

摘要

本发明涉及一种发根农杆菌转化三七细胞的制备方法。本发明采取的技术方案如下：选择实验室已有的生长良好的固体培养或液体培养的三七毛状根作为外植体诱导愈伤组织，具体操作如下：将毛状根剪切成小段，接种于添加有1.0 mg/L 2,4‑D + 0.5 mg/L 6‑BA 的MS固体培养基上，置于25±1℃的暗室培养3‑4周左右即可诱导出愈伤组织；然后接入黄色颗粒状的胚性愈伤组织，在 25±1℃，12 h/d 光照条件下培养 40 d。

主权项

1.一种发根农杆菌转化三七细胞的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）.选择实验室已有的生长良好的固体培养或液体培养的三七毛状根作为外植体诱导愈伤组织，具体操作如下：将毛状根剪切成小段，接种于添加有1.0 mg/L 2,4‑D + 0.5 mg/L 6‑BA 的MS固体培养基上，置于25±1℃的暗室培养3‑4周左右即可诱导出愈伤组织；然后接入黄色颗粒状的胚性愈伤组织，在 25±1℃，12 h/d 光照条件下培养 40 d；（2）.将诱导出的愈伤组织与外植体分离，将分离出的愈伤组织接种于添加有1.0 mg/L 2,4‑D +0.2 mg/L 6‑BA + 0.3mg/L KT的MS固体培养基上进行继代培养，在25±1℃暗培养；25d左右在此培养基上继代一次，新诱导出的愈伤组织色泽暗淡、柔软、水分较大且生长速度较慢，需要经过5次以上的继代培养，愈伤组织逐渐呈现出质地疏松、易分散、不分泌黏液、白色的颗粒状，大约经过10次左右的继代培养，此时的愈伤组织生长速度较快且非常稳定，同时适于做细胞悬浮培养的材料；在无菌操作台上，用镊子将预培养后的三七愈伤组织和叶片、茎段转移到制备好的发根农杆菌的菌液中侵染 30 min，130 r/min、28 ℃，使预培养的外植体与发根农杆菌之间能够充分的接触；侵染结束后，用无菌滤纸将取出的愈伤组织和叶片表面的菌液吸干，然后再转接到含有 0、20、40、60、80、100 mg/L 的乙酰丁香酮的 MS 固体培养基中，25±1 ℃，暗培养条件下进行共培养 2 d；（3）.在无菌操作台上，将在共培养过程中形成菌斑的三七愈伤组织和叶片、茎段用无菌水清洗 2‑3 遍，然后再用无菌滤纸吸干三七的愈伤组织和叶片、茎段表面的多余水分后将其转接到含有 500 mg/L 头孢噻肟钠的 MS 固体培养基上进行除菌培养，每隔一周就要进行继代培养一次，并逐渐的降低除菌抗生素的浓度直至三七愈伤组织和叶片、茎段周围的菌斑完全消失；（4）.当诱导出来的毛状根长到 2‑3 cm 左右时，将毛状根剪下，并转移到含有 200 mg/L卡那霉素的 MS 固体培养基上，25±1 ℃，12 h/d 光照条件下进行培养，培养过程中要筛选出具有卡那霉素抗性的生长速度较快、分支较多的即为三七毛状根。