[发明专利]一种土壤真菌磷组分的液体31PNMR测定方法

摘要

本发明公开了一种土壤真菌磷组分的31P NMR测定方法，该方法采用土壤悬液培养富集土壤真菌样品，真菌样品离心冻干后采用NaOH–EDTA浸提离心的方法将真菌中的磷浸提出来，得到真菌磷浸提液；部分浸提液用于真菌可浸提全磷含量测定，剩余浸提液冷冻干燥处理后，得到粉末样品；将冻干后的粉末用特定混合液重溶解后进行31P NMR上机测试，即可得到真菌磷组分的相关信息。本发明通过对土壤样品真菌富集培养，浸提并测定其磷组分，得到了土壤微生物磷组分测定的新方法，通过对土壤优势真菌磷组分和土壤磷组分的31P NMR谱图对比，对明确土壤微生物磷在土壤中的转化有重要意义。

主权项

一种土壤真菌磷组分的31P NMR测定方法，其特征在于，它包括以下步骤：1)土壤真菌样品的获取：将采集的土样过2mm筛，通过梯度稀释后的土壤悬液涂布于PDA培养基平板，30℃培养若干天，在菌丝长到平板60％面积时，准备土壤浸出液；将土壤浸出液加至500ml三角瓶中，并加入煮熟后的土豆滤液并称取2g葡萄糖、2g琼脂也加至三角瓶中制得培养液，培养液混合均匀后封口灭菌，灭菌后，在超净台将培养液迅速分装至灭菌的平板，冷却至培养液凝固，然后用平口刀割取1cm2左右于PDA培养基平板培养得到的菌种到上述每个平板，用封口膜封口，30℃恒温培养至菌丝长成，待菌丝长成后，用平口刀片在超净台内将平板上层菌丝刮下，用无菌水冲至广口瓶中，刮取完毕将富集的真菌样品冷冻干燥得到真菌样品冻干粉末，备用；2)土壤真菌磷组分的提取：将冻干后的真菌样品称取1.5g于50ml离心管，然后向其中加入30ml NaOH‑EDTA溶液，在20℃条件下低速往复振荡16h，浸提液在10000×g下离心30min，吸取上清液混合后再次进行冷冻干燥得到土壤真菌磷组分冻干粉；3)土壤真菌磷的定量分析：取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml无菌水稀释后，采用ICP‑MS测定真菌磷浸提液的全磷含量，用于谱图中量化分析不同磷化合物的含量；4)真菌磷组分的液体31P NMR测定：将步骤2)得到的土壤真菌磷组分的冻干粉末称取100mg重溶解于0.1mL D2O和0.9mL的1.0M NaOH与100mM Na2EDTA构成的缓冲液共同组成的混合溶液中，移入5mm NMR测试管中进行谱图测定，仪器采用500M核磁测定，延迟时间2.0s，采集时间0.4s，45度脉冲6μs，化学位移范围为50ppm，扫描次数3万次左右，即可获得土壤真菌磷组分的液体31P NMR谱图。