[发明专利]免提取直接扩增的人PAH基因SNP分型快速试纸条检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开一种免提取直接扩增人PAH基因7个热点突变位点(R111X、IVS4‑1、Y204C、R243Q、W326X、Y356X和R413P)的快速试纸条检测方法及试剂盒。该方法包括以下几个步骤：采集的样本直接添加处理液制备成样本液；基于AS‑PCR的方法，对SNP等位基因位点进行识别与扩增；利用扩增片段标记的地高辛和纳米金磁微粒表面的地高辛单抗相互作用，结合侧向流层析技术，实现基因的快速分型。本发明所提供的检测方法，不经过DNA的分离提取过程，同时以表面修饰的金磁微粒作为杂交载体，省去核酸纯化和产物处理环节而导致的高成本、费时、费力的问题的同时，取得了高灵敏度和准确性。

主权项

一种免提取直接扩增的人PAH基因SNP分型快速试纸条检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样本处理：取少量样本，加入样本处理液10μL，静置5分钟后直接作为模板进行下一步反应；(2)针对待检测PAH基因R111X、IVS4‑1、Y204C、R243Q、W326X、Y356X和R413P七个位点，每一个位点分别设计一条野生型特异性引物、一条突变型特异性引物和一条共用引物进行识别与扩增；在野生型特异性引物和突变型特异性引物的5′端均标记地高辛，共用引物的5′端标记生物素；(3)针对每一个样本的每一个位点，平行做两管PCR反应，其中一管加入共用引物与等量的突变型特异性引物，另一管中加入共用引物与等量的野生型特异性引物，两管的PCR反应体系和反应条件相同并同时置于PCR仪中反应，获得扩增产物；(4)利用地高辛单抗修饰的金磁微粒特有的可目视化特性，采用层析技术并以地高辛和地高辛单抗作用、生物素和链亲和素作用，对步骤(3)得到的扩增产物进行试纸条分型检测，判读基因型，滴加含有野生型特异性引物的扩增产物在试纸条的检测线上显色，而含有突变型特异性引物的PCR产物在试纸条的检测线上不显色，则表明基因型为野生型；反之基因型为突变型；若两支试纸条的检测线均显色，则表明基因型为杂合型。