[发明专利]一种快速构建重组质粒的方法

摘要

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种快速构建大肠杆菌重组质粒的方法。包括如下步骤同源重组引物的设计、携带pKD46质粒的E.coli大肠杆菌感受态细胞的制备、带有与质粒同源区段的外源DNA片段的共转化。利用pKD46质粒在L‑阿拉伯糖诱导下稳定地表达Red重组酶，构建出含有Red重组系统的大肠杆菌菌株，重组酶能促进外源DNA片段两端所携带的与质粒同源的区段和线性质粒完成重组，首次实现了利用RED的重组技术将外源DNA片段插入到载体的单一限制性内切酶位点，在37℃培养下可以消除pKD46质粒，不会对后续实验产生干扰，大大简化了重组质粒的构建步骤，缩短了时间。产生的重组质粒经PCR与酶切鉴定后阳性克隆效率较高，可以成为一种构建重组质粒的新手段。

主权项

一种基于Red同源重组技术的快速构建大肠杆菌中重组质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）设计同源重组引物：（1）根据所需要的质粒载体，以及目的基因待插入质粒的位置，选取适当的单一限制性内切酶位点，用相关限制性内切酶对载体做单酶切；（2）从线性载体上的两端选择适当的大小的序列设计同源序列，单侧同源臂长度约20‑100bp；（3）设计PCR扩增目的DNA片段的引物，在其上游与下游引物的5’端分别加上单侧同源臂序列；2）制备携带pKD46质粒的大肠杆菌感受态细胞：（1）将pKD46质粒转化到大肠杆菌中，获得含有pKD46质粒的大肠杆菌菌株；（2）利用L‑阿拉伯糖诱导其产生Red重组酶，并将其制备成感受态细胞；3）共转化：将带有与质粒同源区段的外源DNA片段与线性载体按分子数之比在5:1‑10:1范围内混合，加入到已表达Red重组酶的大肠杆菌感受态细胞，轻轻吹打混匀，冰浴20‑30min，42℃热击90s，热击后迅速放入冰中，冰浴5‑10min，加入适量LB或SOB混匀，30℃摇床复苏45‑60min，离心后，涂布到相应抗性的固体LB平板上，37℃培养过夜；4）提取重组质粒；5）鉴定: 将提取出的重组质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定；6）将含阳性重组质粒的菌株保菌，‑70℃冻存。