[发明专利]构建多西环素调控表达c-met蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞细胞株的方法

摘要

本发明公开一种多西环素调控表达c‑met蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞株的构建方法，即通过构建rtTA基因慢病毒表达载体，并转染到BMSCs中，以获得稳定高效表达rtTA蛋白的BMSCs细胞株(即Tet‑On Advanced BMSCs细胞株)，然后再构建Len‑TRE minCMV‑c‑met/ALB‑GFP慢病毒载体，并转染到Tet‑On Advanced BMSCs中，通过流式细胞仪筛选GFP阳性BMSCs，最终获得GFP（+）Tet‑on‑c‑met BMSCs细胞株；本发明获得的BMSCs细胞株，可以通过加入多西环素诱导表达c‑met蛋白，对于研究该细胞株回输体内治疗肝衰竭，BMSCs顺HGF浓度定向归巢和分化能力，以及该能力与HGF/c‑met轴表达水平之间的量效关系具有重要意义。

主权项

1.一种构建多西环素调控表达c‑met蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞细胞株的方法，其特征在于，具体步骤如下：1）选取4周龄SPF级SD雄性大鼠，提取并培养BMSCs；2）建立Tet‑On Advanced BMSCs细胞株：2.1 分别以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，以pTet‑On dvanced Vector载体为模板，进行PCR扩增，获得目的基因CMV‑rtTA；2.2 以限制性内切酶BamHI、AgeI酶切慢病毒载体GV211，于37℃反应3 h，酶切产物即为线性化载体DNA；酶切体系：10×CutSmart Buffer 5µl，1 µg/µL慢病毒载体GV211 2µl，10 U/µl的限制性内切酶BamHI、AgeI酶1µl，ddH₂O补足至50µl；2.3 配制线性化载体DNA和目的基因重组反应体系，于37℃反应 30 min，获得慢病毒表达载体GV211‑CMV‑rtTA；2.4 向离心管中加入GV211‑CMV‑rtTA 20μg、 pHelper1.0 15μg、pHelper2.0 10μg，以Invitrogen Lipofectamine 2000转染试剂补足至1ml，室温下孵育15min；然后滴入细胞密度为70%～80%的293T细胞中，于37℃，5% CO₂的细胞培养箱培养6h，弃去培养基，加入含10%血清低糖培养基，于37℃、含 5% CO₂的细胞培养箱继续培养 48～72h；2.5 收集步骤2.4培养后的293T细胞上清液，于4℃，4000 g 离心10 min；取上清液以0.45μm 滤器过滤，再收集滤液于4℃，25000 rpm，离心2h；弃去上清，加入病毒保存液,即获得Len‑CMV‑rtTA慢病毒；2.6 将对数生长期的BMSCs接种于96孔板中，每孔加入4～5×10⁴个细胞及100μl含10%血清低糖培养基，当细胞融合度达到30%左右时，弃去培养基，向各孔中加入10μl步骤2.5获得的病毒滴度为2×10⁸ TU/ml的Len‑CMV‑rtTA慢病毒、10μl终浓度为5μg/ml的ploybrene增强液和80μl的含10%血清低糖培养基，于37℃、5% CO₂ 的细胞培养箱培养；感染12h后，弃去培养基，每孔加入100μl含10%血清低糖培养基；感染72h后，再次以含10%血清低糖培养基换液，并向每孔加入终浓度为9μg/ml的嘌呤毒素进行药物筛选，成活细胞即为Tet‑On Advanced BMSCs；3）建立GFP（+）Tet‑on‑c‑met BMSCs细胞株：3.1 合成基因序列TRE‑minCMV启动子‑c‑met ‑ALB启动子‑GFP；所述ALB启动序列如SEQ ID NO.3所示，minCMV启动子序列如SEQ ID NO.4所示，TRE序列如SEQ ID NO.5所示, GFP序列如SEQ ID NO.6所示；3.2配制线性化载体DNA和目的基因重组反应体系：5×CE II Buffer 2µl，步骤2.2获得的浓度为800ng/µL线性化载体 DNA 2.5µl，步骤3.1获得的浓度为800ng/µL的TRE‑minCMV启动子‑c‑met ‑ALB启动子‑GFP 1µl，Exnase II 1µl，ddH₂O补足至10µl；将反应体系置于37℃反应 30 min，获得慢病毒表达载体GV211‑TRE minCMV‑c‑met/ALB‑GFP； 3.3 向离心管中加入GV211‑TRE minCMV‑c‑met/ALB‑GFP 20μg、 pHelper1.0 15μg、pHelper2.0 10μg，以Invitrogen Lipofectamine 2000转染试剂补足至1ml，室温下孵育15min；然后滴入细胞密度为70%～80%的293T细胞中，于37℃，5% CO₂ 培养箱中培养6h，弃去培养基，加入含10%血清低糖培养基，于37℃、含 5% CO₂ 培养箱中继续培养 48‑72h；3.4 收集步骤3.3培养后的293T 细胞上清液，于4℃，4000 g 离心10 min；取上清液以0.45 μm 滤器过滤，再收集滤液于4℃，25000 rpm，离心2h；弃去上清，加入病毒保存液，即获得慢病毒Len‑TRE minCMV‑c‑met/ALB‑GFP；3.5 将对数生长期的Tet‑On Advanced BMSCs接种于96孔板中，每孔加入4～5×10⁴个细胞及100μl含10%血清低糖培养基，当细胞融合度达到30%左右时，弃去培养基，向各孔中加入10μl Len‑TRE minCMV‑c‑met/ALB‑GFP慢病毒、10μl终浓度为5μg/ml的ploybrene增强液和80μl的含10%血清低糖培养基，于37℃、5% CO₂的细胞培养箱培养；感染12h后，弃去培养基，每孔加入100μl含10%血清低糖培养基；感染72h后，再次以含10%血清低糖培养基换液，并向每孔加入终浓度为9μg/ml的嘌呤毒素；通过流式细胞仪筛选GFP阳性BMSCs细胞，即获得GFP（+）Tet‑on‑c‑met BMSCs细胞株；其中，所述含10%血清低糖培养基配制方法为：以质量百分百计，将89%的DMEM/Low培养基、10%的胎牛血清和1%的青霉素‑链霉素溶液混合后获得。