[发明专利]一种基于CRISPR-Cas9技术的miR-126全长基因敲除试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9技术的miR‑126全长基因敲除试剂盒及其应用。本发明优选miR‑126基因上下游CRISPR‑Cas9靶标序列，设计合成针对该靶标序列的sgRNA单链，并构建到载体中，通过转染293T细胞株，sgRNA与trRNA构成特异识别结构，从而引导Cas9酶特异剪切miR‑126基因两端对应序列，持续药筛得到miR‑126全长基因敲除细胞株；经对药筛细胞株测序验证，得到优选的上下游sgRNA组合，该组合的敲除效率高达90％以上，以此构建试剂盒，可对293T、肺癌细胞系A549以及血管内皮细胞HUVEC系等多种类型细胞系进行特异性的miR‑126全长基因敲除。

主权项

1.一种基于CRISPR‑Cas9技术的miR‑126全长基因敲除试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在miR‑126基因序列的上下游两端都设计sgRNA，进行两个位点的同时定点剪切；该试剂盒包括由质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA1和质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA3组成的sgRNA质粒组合；所述质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA1，含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQ ID NO.2所示的miR‑126全长基因的靶标序列的sgRNA，该sgRNA能与trRNA构成特异的识别结构，以致引导Cas9酶特异地剪切miR‑126基因对应序列；所述质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA3，含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQ ID NO.4所示的miR‑126全长基因的靶标序列的sgRNA，该sgRNA能与trRNA构成特异的识别结构，以致引导Cas9酶特异地剪切miR‑126基因对应序列；或者，该试剂盒包括由质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA2和质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA5组成的sgRNA质粒组合；所述质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA2，含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQ ID NO.3所示的miR‑126全长基因的靶标序列的sgRNA，该sgRNA能与trRNA构成特异的识别结构，以致引导Cas9酶特异地剪切miR‑126基因对应序列；所述质粒pSpCas9(BB)‑2A‑Puro‑sgRNA5，含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQ ID NO.6所示的miR‑126全长基因的靶标序列的sgRNA，该sgRNA能与trRNA构成特异的识别结构，以致引导Cas9酶特异地剪切miR‑126基因对应序列。