[发明专利]一种大理裂腹鱼肾脏细胞系的构建方法

摘要

本发明涉及一种大理裂腹鱼肾脏细胞系的构建方法，该方法包括如下步骤：1)大理裂腹鱼肾脏组织的获取：采用高锰酸钾和酒精联合对大理裂腹鱼进行消毒；2)原代培养：采用含有细胞生长因子、青霉素、链霉素、两性霉素B，渗透压为的280‑300mOsm/L的L‑15或DMEM/F12培养液进行培养；3)传代培养：传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，所述大理裂腹鱼肾脏细胞系建立成功。本发明的构建方法所获得的大理裂腹鱼肾脏细胞系形态为成纤维样，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，不仅能满足对大理裂腹鱼这一珍稀物种种质资源保存和理论研究的需要，同时也是大理裂腹鱼的首个细胞系，为大理裂腹鱼细胞水平的高原适应性研究奠定了基础。

主权项

1.一种大理裂腹鱼肾脏细胞系的构建方法，其特征在于构建方法包括如下步骤：1)大理裂腹鱼肾脏的获取：先用10‑20mg/L的高锰酸钾浸泡消毒大理裂腹鱼鱼体10‑20分钟，再用80‑100ppm的MS‑222麻醉大理裂腹鱼鱼体；再以75％酒精擦拭鱼体后，取其肾脏，加入PBS消毒液清洗大理裂腹鱼鱼体的肾脏组织；所述PBS消毒液为含有浓度为100‑300IU/mL的青霉素、浓度为100‑300μg/mL的链霉素以及浓度为20‑40μg/mL的两性霉素B的混合溶液；2)原代培养：将步骤1)获得的肾脏组织剪成组织小块，并将其接种于25cm²细胞培养瓶中，在18‑20℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液，在18‑20℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第10‑12天细胞开始从组织块中迁移，30‑40天长成细胞单层，则原代肾脏细胞；3)传代培养：原代肾脏细胞铺满瓶底80％后开始传代，先吸出培养瓶中的原代培养液，以含0.1‑0.2％的胰蛋白酶‑EDTA的胰酶消化法传代悬起细胞，加入传代培养液1‑2mL以中和胰酶反应，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于18‑20℃培养箱中继续培养；每5‑7天传代一次，传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，所述大理裂腹鱼肾脏细胞系建立成功；所述的基础培养液为含有浓度为6‑10ng/mL的bFGF和占总体积的10‑15％的胎牛血清的L‑15或DMEM/F12培养液的混合溶液；所述的原代培养液为含有浓度为6‑10ng/mL的bFGF、占总体积的15‑20％的胎牛血清、浓度为200‑300IU/mL的青霉素、浓度为200‑300μg/mL的链霉素以及浓度为20‑40μg/mL的两性霉素B的L‑15或DMEM/F12培养液的混合溶液；所述的传代培养液为含有浓度为6‑10ng/mL的bFGF、占总体积的15‑20％的胎牛血清、浓度为100‑200IU/mL的青霉素、浓度为100‑200μg/mL的链霉素以及浓度为15‑20μg/mL的两性霉素B的L‑15或DMEM/F12培养液的混合溶液；所述原代培养液、所述传代培养液和所述基础培养液的pH值均为7.0‑7.2；所述原代培养液、所述传代培养液和所述基础培养液的渗透压均为280‑300mOsm/L；4)细胞冻存与复苏的步骤：a)配制细胞冻存液：冻存液包括L‑15或DMEM/F12培养液、胎牛血清和DMSO，按3：6：1的体积比混合，现用现配；b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液800‑1200rpm离心6‑10分钟，弃掉上清液；向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1×10⁶个/mL，将1mL细胞悬液转移至1.8mL冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，‑80℃放置24‑48小时，然后放入液氮中长期保存；c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入30℃水浴锅中快速摇晃至融化；然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15mL离心管中，并加入等量基础培养液，800‑1000rpm离心6‑8分钟，除上清液；用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，18‑20℃培养箱中培养，8‑10天细胞即长成单层。