[发明专利]单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法

摘要

本发明公开了一种单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，采用累代单蛾区饲养、标记基因筛选、雄蛾测交、雌蛾进行PCR扩增和后期与常规品种杂交检测相结合来进行单拷贝转基因家蚕纯合品系的筛选。该法操作技术要求低，缩短了获得基因型纯合的转基因家蚕所需的时间，所得纯合品系后代的转基因表达率均在98％以上。应用本发明进行转羊毛KAP5.4基因家蚕纯合品系的筛选和培育，在3代内就能筛选出所需的纯合系，大大缩短了育种周期。因此，本发明可高效筛选获得单拷贝转基因家蚕纯合品系，为转基因家蚕品种的培育提供重要的技术支撑，若广泛应用于转基因家蚕品种培育研究可为培育综合经济性状优良的转基因家蚕品种奠定坚实的基础。

主权项

1.一种单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，其特征在于采用累代单蛾区饲养、标记基因筛选、雄蛾测交、雌蛾进行PCR扩增和后期与常规品种杂交检测相结合来进行单拷贝转基因家蚕纯合品系的筛选；所述转基因家蚕为转羊毛KAP5.4基因家蚕；具体按以下步骤操作进行：<1>使用非转基因蚕品种与单拷贝转基因家蚕阳性个体杂交，获得杂交F1代；<2>浸酸、催青F1代蚕卵至转青，挑选转入标记基因有表达的蛾区进行饲养；<3>饲养步骤<2>挑选出的F1代蛾区至大蚕期，调查同一蛾圈内所有个体标记基因表达分离比，调查结束后淘汰不表达所转入基因的个体，挑选出目的基因有表达的个体饲养至化蛾，然后雌雄个体自交获得杂交F2代；<4>浸酸、催青杂交F2代蚕卵至转青，挑选转入标记基因有表达的蛾圈进行饲养，淘汰转入标记基因不表达的蛾圈；<5>饲养步骤<4>挑选出的F2代蛾圈至大蚕期，调查同一蛾圈内所有个体标记基因表达分离比，调查结束后淘汰不表达所转入基因的个体，挑选出目的基因有表达的个体饲养至化蛾，然后雌雄个体自交获得自交F3代；自交结束后，对应的雄蛾再与常规非转基因品种雌蛾重交获得测交系，命名为F3代测交，测交系与自交系的各个蛾圈的蚕卵均一一对应编号；自交对应雌蛾产完卵以后也一一编号，每个雌蛾用剪刀一分为二，一半装入离心管放‑20℃冻存，另一半送检毒室进行常规检疫；<6>浸酸、催青自交F3代和对应的测交系蚕卵至转青，通过筛选标记筛选，检测雄蛾的纯合性；自交和对应测交系标记基因表达率均为100％的蛾圈所对应的父本是纯合子，保留下该自交蛾圈卵，淘汰任何标记基因表达率不为100％的蛾圈；<7>选取步骤<6>中保留蛾圈所对应的母蛾编号，取出步骤<5>中对应编号冻存的离心管，提取其中母蛾的基因组DNA，然后利用特异引物进行PCR扩增，根据扩增结果保留对应编号的卵；步骤<7>中的特异性引物是根据外源转入基因在染色体上插入位点上下游的基因组序列以及转基因结构序列设计的PCR引物F、R和LR；它们分别具有以下碱基序列：KAP5.4基因鉴定引物：F：5’‑CTGTAGGAGTATCAAGAACGGAGATG‑3’，R：5’‑GACAGACAGATATAGGGACAGAGAAAGC‑3’；piggyBac转座子结合引物：LR:5’‑CAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGC‑3’；<8>保留根据步骤<6>和<7>筛选出父本和母本均为纯合子所产下的蛾圈，饲养继代，筛选出的自交F3代即为该单拷贝转基因家蚕纯合品系。