[发明专利]一种PEP‑1肽介导绿色荧光蛋白转导水牛胚胎的方法

摘要

本发明涉及细胞穿膜肽靶向运输的技术领域，特别涉及一种PEP‑1肽介导绿色荧光蛋白转导水牛胚胎的方法，所述方法包括PEP‑1‑EGFP和EGFP片段的优化、原核表达载体pCZN1‑PEP‑1‑EGFP和pCZN1‑EGFP的构建、蛋白的原核表达、蛋白转染等步骤，发明利用基因工程的手段，构建PEP‑1肽介导的表达载体质粒pCZN1‑PEP‑1‑EGFP和空白对照的pCZN1‑EGFP载体质粒，探索PEP‑1肽介导绿色荧光蛋白转导细胞的最佳条件，能精确、高效的将绿色荧光蛋白转导到水牛胚胎中，为研究营养物质的靶向转导、药物的靶向作用奠定了研究基础，能高效的发挥PEP‑1肽的介导作用。

主权项

一种PEP‑1肽介导绿色荧光蛋白转导水牛胚胎的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)PEP‑1‑EGFP和EGFP片段的优化：将PEP‑1肽段连接到EGFP蛋白的N端，形成PEP‑1‑EGFP融合片段，对融合片段进行密码子优化，并亚克隆至puc57‑simple载体中，命名为，puc57‑PEP‑1‑EGFP；将EGFP蛋白片段亚克隆至puc57‑simple载体中，命名为，puc57‑EGFP；(2)原核表达载体pCZN1‑PEP‑1‑EGFP和pCZN1‑EGFP的构建：A、用NdeⅠ和XbaⅠ酶切所述puc57‑PEP‑1‑EGFP和puc57‑EGFP，切胶回收获得PEP‑1‑EGFP和EGFP片段；B、用NdeⅠ和XbaⅠ酶切pCZN1载体，切胶回收获得线性化的pCZN1载体片段；C、将PEP‑1‑EGFP和EGFP片段分别与线性化的pCZN1载体片段进行连接，将连接产物导入感受态细胞进行转化，扩大培养，提取质粒，得到pCZN1‑PEP‑1‑EGFP和pCZN1‑EGFP载体质粒；(3)蛋白的原核表达：将步骤(2)中构建好的pCZN1‑PEP‑1‑EGFP和pCZN1‑EGFP载体质粒分别转染表达菌株，提取质粒经过琼脂糖凝胶电泳验证，获得阳性克隆；将阳性克隆菌接种于细菌培养液中并加入IPTG进行诱导蛋白PEP‑1‑EGFP‑His和EGFP‑His表达，并通过SDS‑PAGE分析诱导后的蛋白表达情况，收集诱导表达后的菌体进行蛋白纯化，通过SDS‑PAGE分析纯化后的蛋白表达情况，并通过应用HIS抗体进行蛋白印迹，检测所表达纯化的PEP‑1‑EGFP‑His和EGFP‑His蛋白；(4)蛋白转染：用PEP‑1‑EGFP‑His和EGFP‑His蛋白转染CHO细胞，并进行跟踪记录，根据记录情况选取PEP‑1‑EGFP‑His和EGFP‑His蛋白转染CHO细胞的最佳浓度、时间，对水牛的胚胎细胞进行转染。