[发明专利]鞍带石斑鱼精子冷冻库建立及辅助石斑鱼远缘杂交育种方法

摘要

本发明公开了一种鞍带石斑鱼精子冷冻库建立及辅助石斑鱼远缘杂交育种方法，所述精子冷冻库建立步骤为配制精子稀释液、配制精子冷冻保存液、精子冷冻保存、精子冷冻库建立。所述石斑鱼远缘杂交方法包括建立鞍带石斑鱼精子冷冻库、构建云纹石斑鱼育种群体、培育云纹石斑鱼亲鱼和生殖调控、对云纹石斑鱼雌性亲鱼进行人工催产繁殖、冷冻精子受精和孵化、苗种培育。本发明在国内建立了第一个鞍带石斑鱼精子冷冻库，克服了石斑鱼因为地理分布、适温范围和繁殖时间等方面的因素造成的生殖隔离，使石斑鱼种群间远缘杂交成为可能，从而培育出远缘杂交品种。

主权项

1.一种石斑鱼远缘杂交育种方法，其特征在于，步骤为：（1）配制精子稀释液：包括葡萄糖49.97g/L、NaCl 6.5g/L、NaHCO₃ 0.199g/L、KCl 0.14 g/L、CaCl₂·2H₂O 0.12 g/L、NaH₂PO₄ 0.0098 g/L，溶解在蒸馏水中；（2）配制精子冷冻保存液：在上述精子稀释液中加入15% 二甲基亚砜和10%小牛血清，均为体积百分数；（3）精子冷冻保存：将鞍带石斑鱼精液与精子冷冻保存液以1:1的体积比混合，分装后在液氮罐蒸气中平衡，平衡温度为‑140℃，平衡时间为10min，然后直接投入液氮中冷冻保存，冷冻保存温度为‑196℃；（4）精子冷冻库建立：收集不同养殖群体和野生群体的鞍带石斑鱼精液，在液氮中冷冻保存，建立鞍带石斑鱼精子冷冻库；（5）构建云纹石斑鱼育种群体：收集野生或养殖云纹石斑鱼，养殖群体中以5%的选择强度筛选，云纹石斑鱼要求体形正常无畸形、体表无伤痕、体色为褐色或棕色，体侧有六条暗棕色横纹，体上具有云状白色块纹，体重在3.5kg以上，体长40cm以上的正常发育个体，对亲鱼生长性状进行测量，并注射电子标记，采集DNA样本，建立育种群体档案，构建云纹石斑鱼育种群体；（6）培育云纹石斑鱼亲鱼和生殖调控：亲鱼在工厂化流水培育池中培育，亲鱼培育时控制冬季水温15‑16℃，夏季水温25‑26℃，盐度28‑31‰，溶解氧≥10 mg/L，光照度≤5000 Lx，光照节律与自然光相同，昼夜水循环10‑15 次，定时、定量投喂野杂鱼；进入繁殖季节后，重新调整培育池的水温及光照时间，将培育池水温逐渐提高到24℃，光照时间调整为14h，在投喂饲料中添加维生素C 5‰、维生素E3‰，培育2个月左右达到性成熟；（7）对云纹石斑鱼雌性亲鱼进行人工催产繁殖：选择腹部膨大、发育良好的云纹石斑鱼雌性亲鱼，注射催产激素，催产激素为绒毛膜促性腺激素HCG 200‑300IU/kg和促排卵激素类似物LHRH‑A3 5μg/kg的混合物，进行肌肉注射催产，催产后24h人工挤压腹部采卵，之后人工挤压腹部采卵；（8）冷冻精子受精和孵化：从鞍带石斑鱼精子冷冻库中选取精子，在37℃水浴中解冻，将解冻精子与云纹石斑鱼卵进行干法受精，干法受精过程是将解冻精子与云纹石斑鱼卵以1:200的体积比混合，再加入2倍体积的海水后静置4‑6min，利用盐度为35‰的海水漂洗，分离上浮受精卵，放入网箱孵化，海水温度保持在24℃、盐度30‰、溶解氧6‑10mg/L，水流保持0.2m³/h，分离上浮受精卵，放入网箱孵化；孵化到尾芽期后，收集上浮卵放入苗种池孵化和培育；（9）苗种培育：利用微流水进行苗种培育，苗种培育时水温26‑27℃，盐度30‰，溶解氧（DO）≥10 mg /L，pH 7.8‑8.2；初期水流量0.3m³/h， 20天后水流增大到2m³/h，30天后水流增大到3‑5m³/h，在水体中加入小球藻，密度为(5‑10)×10⁵cells /mL；孵化后3‑4天投喂轮虫，投喂密度为8‑15 ind /mL，日投喂2 次；10日龄后增加投喂卤虫无节幼体，投喂密度1‑2 ind /mL，日投喂2 次，25日龄开始投喂配合饲料，培育到40天左右鱼苗完成变态发育，进入幼鱼期。