[发明专利]一种葡萄状枝瑚菌中抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种葡萄状枝瑚菌中抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法及应用，本发明的抗肿瘤蛋白提取物是将葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis子实体研磨成粉末后，经浸提、盐析、透析、冻干、离子交换和凝胶层析而获得。该蛋白提取物是分子量为18.5kDa的单体蛋白，氨基酸序列与鬼伞科真菌Coprinellus Congregatus的泛素蛋白p19848有69％的相似度，是一种类泛素蛋白；对人肺腺癌细胞株A549的生长具有明显的抑制作用。本发明的葡萄状枝瑚菌(Ramaria botrytis)抗肿瘤蛋白提取物为天然提取物，对人类和环境均无害；制备方法简单，成本较低，适于工业化生产。

主权项

1.一种葡萄状枝瑚菌中抗肿瘤蛋白提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）将葡萄状枝瑚菌子实体 50~70℃烘干并研磨成粉，溶解于0.2~0.5 M 的NaCl溶液中，2~6℃浸提8~16小时，4000~8000 rpm离心10~20 min，收集上清液；2）向上清液中加入( NH₄) ₂ SO₄至饱和度为70~100%，2~6℃放置8~16小时， 10000~20000 rpm离心10~40 min，收集沉淀，即得葡萄状枝瑚菌蛋白粗提物；3）将葡萄状枝瑚菌蛋白粗提物用10~50 mM、pH 6.0~8.0的Tris‑HCl缓冲液溶解，然后在2~6℃、5~10倍重量的该缓冲液中透析8~20小时，反复3~5次，透析后14000 rpm离心10 min收集上清液并进行冷冻干燥，即得葡萄状枝瑚菌蛋白粗粉；4）将葡萄状枝瑚菌蛋白粗粉溶解于10~50 mM、pH 6.0~8.0的Tris‑HCl缓冲液中，用0.15，0.3和0.5 mol/L NaCl 依次进行DEAE‑Sepharose Fast Flow阴离子交换洗脱，收集洗脱峰；5）将0.3 mol/L NaCl洗脱峰组分上样于凝胶层析柱Sephadex G‑75，用10~50 mM Tris‑HCl、200~500mM NaCl，pH 6.0~8.0缓冲液洗脱，收集第二个洗脱峰，获得葡萄状枝瑚菌抗肿瘤蛋白提取物；步骤1）中葡萄状枝瑚菌子实体粉与NaCl溶液的料液比为1:20。