[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9系统共同敲除绵羊MSTN、ASIP、BCO2基因的方法

摘要

本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9系统共同敲除绵羊MSTN、ASIP、BCO2基因的方法。本发明首先获得针对绵羊MSTN第二外显子和第三外显子的sgRNA识别区的两段DNA序列、针对绵羊ASIP第五外显子的sgRNA识别区的两段DNA序列、针对绵羊BCO2第二外显子的sgRNA识别区的两段DNA序列，分别设计并和成相应的sgRNA寡核苷酸序列；接着分别构建针对绵羊MSTN第二外显子和第三外显子、针对绵羊ASIP第五外显子、针对绵羊BCO2第二外显子，且含T7启动子的saRNA体外转录载体；利用Cas9和sgRNA的体外转录载体通过体外转录获得Cas9 mRNA和sgRNA，通过受精卵注射可用于生产MSTN、ASIP、BCO2共同敲除的转基因绵羊。

主权项

一种利用CRISPR/Cas9系统共同敲除绵羊MSTN、ASIP、BCO2基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建特异性靶向：MSTN第二外显子和第三外显子、ASIP第五外显子、BCO2第二外显子的sgRNA的体外转录载体；通过体外转录得到针对MSTN第二外显子和第三外显子的sgRNA‑1M、sgRNA‑2M，针对ASIP第五外显子的sgRNA‑1A、sgRNA‑2A，针对绵羊BCO2第二外显子的sgRNA‑1B、sgRNA‑2B；(2)体外转录Cas9蛋白的体外转录载体，得到Cas9 mRNA；(3)将步骤(1)和步骤(2)的sgRNA‑1M、sgRNA‑2M、sgRNA‑1A、sgRNA‑2A、sgRNA‑1B、sgRNA‑2B及Cas9 mRNA纯化后测浓度，然后将sgRNA‑1M、sgRNA‑2M、sgRNA‑1A、sgRNA‑2A、sgRNA‑1B、sgRNA‑2B与Cas9 mRNA混合，注射入绵羊受精卵细胞质中，然后经体外培养后移植入同种雌性绵羊输卵管中，用于生产共同敲除MSTN、ASIP、BCO2基因的转基因绵羊。