[发明专利]利用松散型胚性愈伤组织诱变获得耐盐苜蓿新品种的方法

摘要

本发明公开了一种利用松散型胚性愈伤组织诱变获得耐盐苜蓿新品种的方法，步骤如下：⑴获取苜蓿无菌苗；⑵苜蓿松软愈伤组织的诱导；⑶苜蓿胚性愈伤组织的诱导；⑷苜蓿松散型胚性愈伤组织的诱导；⑸诱变材料的制备；⑹耐盐细胞系的筛选；⑺耐盐突变株的培养。本发明主要内容是先诱导出苜蓿松散型胚性愈伤组织，再以化学诱变剂对愈伤组织进行体外诱变，并将诱变后的苜蓿松散型胚性愈伤组织转移到含有一定浓度盐的培养基上进行定向筛选，从而获得耐盐的苜蓿突变愈伤组织，经过再生培养，最终得到苜蓿耐盐突变株。

主权项

一种利用松散型胚性愈伤组织诱变获得耐盐苜蓿新品种的方法，其特征在于：步骤如下⑴获取苜蓿无菌苗；⑵苜蓿松软愈伤组织的诱导采用苜蓿组培苗的下胚轴为外植体，在1/2MS+0.5‑1.0mg/L2.4‑D+20g/L蔗糖培养基上诱导；培养条件为：温度24‑25℃，24h光照，光照强度为2000Lux，20‑25d即可获得理想的松软型愈伤组织；⑶苜蓿胚性愈伤组织的诱导将步骤⑵中诱导出的松软愈伤组织从外植体上分离下来，将其接种在事先配好的MS+1‑2mg/LKT+0.5mg/L2,4‑D+30g/L蔗糖的培养基上诱导愈伤组织；培养条件为：温度22‑23℃，24h光照，光照强度为2500Lux；接种14‑16d后继代一次，所用培养基和培养条件不变；在继代时尽量转移质地较硬的愈伤组织，大约经过3‑5次继代后，愈伤组织质地完全变硬，并在镜检时，愈伤组织基本由体积小、球形、细胞质浓、细胞核大并含有多个分裂相的细胞构成，此时说明已经诱导出了苜蓿的胚性愈伤组织；⑷苜蓿松散型胚性愈伤组织的诱导将步骤⑶中诱导出的苜蓿胚性愈伤组织分成直径为3‑5mm的小块，然后将其接种到MS+1mg/LKT+0.5mg/L2,4‑D+30g/L蔗糖的培养基上；在20‑22℃下培养，并在7‑10d继代一次，经过5‑8次继代培养，愈伤组织在结构上出现明显的变化，当出现结构松散、质地紧密，镜检为胚性愈伤组织时，此时即获得了苜蓿松散型胚性愈伤组织；培养愈伤组织时采用24h光照，光照强度为2500Lux；⑸诱变材料的制备将诱导出的苜蓿松散型胚性愈伤组织在超净台中用解剖刀分成直径大小为2‑3mm的小块，放到培养皿中备用；另将愈伤组织培养基(MS+1‑0.5mg/LKT+1‑0.5mg/L2,4‑D+30g/L蔗糖)在微波炉中融化，待其温度降到50℃时，加入0.3％的EMS，然后分装到100ml的三角瓶中，每瓶倒入20ml的培养基；待到培养基凝固后将愈伤组织接种到三角瓶中进行培养；培养条件为24℃,24h光照，光照强度为2000Lux；⑹耐盐细胞系的筛选经过20d的诱变处理后，将生长正常的愈伤组织转移到含有0.8‑1.0％NaCl浓度的培养基上进行耐盐筛选，经过20d的生长，从中筛选出生长正常并具备再生能力的愈伤组织；培养条件为23‑24℃,24h光照，光照强度为3000Lux；⑺耐盐突变株的培养将筛选出的耐盐愈伤组织转移到不含激素的MS培养基上诱导再生植株；培养基中加入浓度为0.8‑1.0％NaCl，经过20‑30d的生长，即可获得生长健壮的耐盐苜蓿再生植株；此过程的培养条件为24‑25℃,24h光照，光照强度为3000Lux。