[发明专利]一种非疾病诊断和治疗目的的检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法

摘要

本发明涉及一种检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法，属于动物卫生检测技术领域，其特征在于，包括以下步骤：首先采集血清样品，采用“胰酶‑高铁酸钠‑过氧化氢‑聚乙二醇”方法处理血清样品，去除其中的非特异性凝血因子，得待检血清；采用倍比稀释的方法确定4个血凝单位的抗原浓度；在V型微量反应板上使待检血清、待检抗原和鸡红细胞悬液发生反应，以完全抑制4个血凝单位待检抗原的待检血清的最高稀释倍数作为血清抗体的效价，确定血清抗体效价为阳性的待检血清。本发明所述方法简单有效，成本低，可用于对数量较多的血清样品进行阳性率分析，为动物疾病治疗与预防奠定基础。

主权项

1.一种非疾病诊断和治疗目的的检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、采集血清样品，按照不同地点将其分成不同组，对每组中的每份血清样品进行处理，处理步骤为：在每30μL血清样品中加入15μL 8mg/mL的胰酶溶液，56℃水浴处理30min，加入60μL 2.3mg/mL的高铁酸钠水溶液和60μL 体积百分数为3%的过氧化氢水溶液，混匀后室温静置15min，再加60μL质量体积百分数为0.5%的聚乙二醇水溶液，混匀后室温静置10min，与75μL的PBS溶液混合，得待检血清；取待检血清和体积分数为1%的鸡红细胞悬液，按照1:1的体积比将两者进行混合，鸡红细胞呈泪滴状下沉，血清样品处理成功，待检血清用于后续步骤；步骤二、在V型微量反应板的2-12孔中分别加入50μL的PBS溶液；在第1孔中加入100μL待检抗原，将其吸出50μL置于第2孔中，混匀后从第2孔中吸出50μL置于第3孔中，依次进行系列倍比稀释至第11孔，弃最终的50μL；在第1至12孔中加入50μL的1%的鸡红细胞悬液，将V型微量反应板置于微量振荡器上处理1-2min，37℃静置15min，观察结果，获取待检抗原的血凝单位；步骤三、根据步骤二的结果配制浓度为4个血凝单位的待检抗原，在V型微量反应板的2-11孔中分别加入25μL的PBS溶液，第12孔加入50μL的PBS溶液；在第1孔加入50μL处理好的待检血清，将其吸出25μL置于第2孔中，混匀后从第2孔中吸出25μL置于第3孔中，依次进行系列倍比稀释至第10孔，弃最终的25μL；在第1-11孔中分别加入25μL 浓度为4 个血凝单位的待检抗原，37℃静置30分钟，第1-12孔中分别加入50μL的1%的鸡红细胞悬液；以完全抑制4个血凝单位待检抗原的待检血清最高稀释倍数作为血清抗体的效价，血清抗体效价≥40时为阳性；步骤四、对步骤三获得的数据进行统计分析，比较不同组待检血清阳性率的差异是否显著。