[发明专利]一种构建基因替代小鼠研究野生型和突变体非肌性肌球蛋白重链II功能的方法

摘要

本发明提供了一种构建基因替代小鼠研究野生型和突变体非肌性肌球蛋白重链II功能的方法。本发明改造的mpNTKV‑LoxP载体更适合于构建基因打靶载体特别是基因替代目的，新加入的Pac I和Swa I都是识别八个碱基的限制性内切酶，有利于较大DNA片段的插入。构建的MYH9基因替代(即内源MYH9基因被外源编码非肌性肌球蛋白重链II基因所替代)打靶载体通过电转导入小鼠ES细胞中，经过药物筛选，ES细胞单克隆挑选，Southern Blot或PCR鉴定，发生同源重组的阳性单克隆细胞率高达90％以上，易于获得所需细胞系。使用阳性ES细胞显微注射至小鼠囊胚获得MYH9基因替代嵌合体小鼠，并且该嵌合体小鼠可以交配传代，从而获得MYH9基因替代杂合子及纯合子后代。

主权项

1.一种构建基因替代小鼠研究野生型和突变体非肌性肌球蛋白重链II功能的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)构建mpNTKV‑LoxP载体，所述mpNTKV‑LoxP载体序列如SEQ ID NO.4所示；(2)在mpNTKV‑LoxP载体基础上构建靶向MYH9基因的打靶载体：将小鼠MYH9基因外显子2上游4.0kb和下游1.7kkb DNA序列分别插入mpNTKV‑LoxP载体中获得靶向MYH9基因的打靶载体，命名为mpNTKV‑LoxP MAL‑MAR靶向载体，所述mpNTKV‑LoxP MAL‑MAR靶向载体序列如SEQ ID NO.25所示；(3)将拟替代内源MYH9基因的编码融合荧光蛋白的非肌性肌球蛋白重链II的cDNA分别插入靶向MYH9基因打靶载体中从而获得三个不同的MYH9基因替代打靶载体，所述不同的MYH9基因替代打靶载体分别命名为打靶载体1、打靶载体2、打靶载体3；所述打靶载体1的序列如SEQ ID NO.26所示、所述打靶载体2的序列如SEQ ID NO.27所示、所述打靶载体3的序列如SEQ ID NO.28所示；(4)将构建的MYH9基因替代打靶载体通过电转导入小鼠ES细胞中，经药物筛选得到细胞单克隆，经Southern Blot或PCR鉴定细胞单克隆，进而获得MYH9基因替代ES细胞系，所述MYH9基因替代ES细胞系用于产生MYH9基因替代小鼠。