[发明专利]一种治疗代谢疾病的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种治疗代谢疾病的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其制备方法和应用，将重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白编码基因的核苷酸序列与表达载体相连接得到重组表达载体；再将该重组表达载体转化宿主细胞，然后筛选高表达阳性宿主细胞，培养细胞并诱导表达重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白，收集菌体、破碎、离心、澄清、纯化，得到目标产物治疗代谢疾病的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白。本发明还公开了该重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白在制备治疗代谢疾病药物中的应用。本发明的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白能够较好的控制血糖波动，稳定维持24小时血糖处于正常水平。

主权项

1.重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用，所述重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白是将人成纤维细胞生长因子21重组蛋白mFGF21与HSA或3DHSA连接而成的重组融合蛋白mFGF21‑HSA、HSA‑mFGF21、mFGF21‑3DHSA和3DHSA‑mFGF21，其中重组蛋白mFGF21的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，重组融合蛋白mFGF21‑HSA的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，重组融合蛋白HSA‑mFGF21的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示，重组融合蛋白mFGF21‑3DHSA的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，重组融合蛋白3DHSA‑mFGF21的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示，其特征在于：mFGF21‑HSA、HSA‑mFGF21、mFGF21‑3DHSA和3DHSA‑mFGF21的制备方法包括如下步骤：（1）mFGF21‑HSA、HSA‑mFGF21、mFGF21‑3DHSA和3DHSA‑mFGF21表达载体的构建：根据大肠杆菌密码子偏好性，设计出4种基因，其核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，同时在各基因两端设计NdeI与BamHI两酶切位点，将4种合成的含有各自目的基因片段的载体和pET30a（+）分别用NdeI与Bam HI双酶切，酶切完毕后，胶回收各自需要的目标片段，使用T4 DNA连接酶将4种目的片段分别与原核表达载体pET30a（+）连接，连接反应体系为10μL，混匀，4℃连接过夜，然后各自转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆，经过酶切鉴定后，即分别构建得到4种重组质粒pET30a‑mFGF21‑HSA、pET30a‑HSA‑mFGF21、pET30a‑mFGF21‑3DHSA和pET30a‑3DHSAmFGF21；（2）mFGF21‑HSA、HSA‑mFGF21、mFGF21‑3DHSA和3DHSA‑mFGF21四种融合蛋白的表达：将含有正确序列的4种重组质粒pET30a‑mFGF21‑HSA、pET30a‑HSA‑mFGF21、pET30amFGF21‑3DHSA和pET30a‑3DHSA‑mFGF21分别转化至表达菌株Rosseta，转化后的单菌落分别接种至20mL含50μg/mL Kan的LB培养基中，37℃培养8h，以体积比为1:100接种于另一20mL含50μg/mL Kan的LB培养基中，37℃培养，当A600在0.35左右时，加入IPTG至终浓度为0.25mmol/L进行诱导，诱导温度为30℃，5h后收获菌体，用20mmol/L Na₃PO₄，pH 7.0的Binding buffer重悬菌体，破碎菌体后离心；（3）mFGF21‑HSA、HSA‑mFGF21、mFGF21‑3DHSA和3DHSA‑mFGF21四种融合蛋白的纯化：向菌体中加入1mg/mL的溶菌酶，冰上放置30min；超声破碎菌体细胞，超声条件为工作1s，间隔1s，4min/次，共3次循环；破碎彻底后，12000rpm，4℃离心15min，收集上清，上清液过0.22μm滤膜澄清后，通过泵进入AKTA purifier 100系统，与2‑3倍柱体积Binding buffer平衡好的、装于XK16/20空柱、柱高10cm、流速100cm/h的Blue Sepharose 6FF柱完全结合后，用4‑5倍柱体积的binding buffer冲洗杂蛋白，当紫外曲线达到稳定的基线时，再用2‑3倍柱体积的20mmol/L Na₃PO₄、2mol/L NaCl、pH 7.0的Elution buffer洗脱目的蛋白，把结合在填料上的融合蛋白洗脱下来并收集到试管中。