[发明专利]一种pPIC9-ompA-Fc重组质粒、构建方法、在毕赤酵母表达系统中的诱导表达及其应用

摘要

本发明提供了一种pPIC9‑ompA‑Fc重组质粒、构建方法、表达及其应用，属于基因工程技术领域，以禽波氏杆菌DNA及以鸡脾脏mRNA为模版合成的cDNA为模版，通过PCR分别获得ompA‑linker基因和鸡IgY‑Fc‑linker基因，再将两份PCR产物进行SOE‑PCR得到ompA‑linker‑Fc融合基因，将融合基因连接至PMD18‑T克隆质粒，连接转化后对重组质粒进行测序，双酶切并连接至表达质粒pPIC9中，将连接产物转化受体菌，最后鉴定阳性转化子，获得pPIC9‑ompA‑Fc融合质粒。本发明成功克隆禽波氏杆菌ompA及鸡IgY Fc，并将两种基因成功融合至表达质粒，实现了重组质粒毕赤酵母高效表达，成本低廉，增强了融合蛋白的活性。

主权项

一种pPIC9‑ompA‑Fc重组质粒，其特征在于，根据NCBI中查找的禽波氏杆菌标准株ompA，（如SEQ ID NO：1）和鸡IgY Fc，（如SEQ ID NO：2）的核苷酸序列，设计两对特异性引物，并在引物中插入限制性内切酶酶切位点和linker连接子，（如SEQ ID NO：4 5 6 7所示，）通过PCR方式分别扩增出两个基因ompA‑linker和IgY Fc‑linker，并通过SOE‑PCR方法将两个基因融合成ompA‑Fc基因片段，（如SEQ ID NO：3 所示，）以含氨苄青霉素筛选标签的pPIC9 表达质粒为载体，在pPIC9的限制性酶切位点Not I和Xhol I之间插入ompA‑Fc基因全长，构建成一种含ompA‑Fc基因全长和氨苄青霉素筛选标签的pPIC9重组质粒，即pPIC9‑ompA‑Fc 重组质粒。