[发明专利]一种载抗菌肽基因的药物递送系统及构建和应用

摘要

本发明的目的在于提供一种以牛抗菌肽BMAP27为治疗基因的药物递送系统、包括基因表达载体、药物递送载体及其制备方法与应用。它是利用分子克隆技术，包括PCR技术、点突变技术和酶切插入连接等，构建携带有BMAP27基因的分泌型真核表达质粒。将裸质粒DNA用壳聚糖纳米粒包封，制备成载抗菌肽基因的壳聚糖纳米递送系统。本发明的药物递送系统可有效介导基因药物在真核细胞中表达并分泌到胞外，对奶牛乳腺炎具有较好的疗效。

主权项

1.一种载抗菌肽基因的药物递送系统，其特征在于，所述载抗菌肽基因的药物递送系统由以下步骤制得：(1)pEGFP‑C3‑SP质粒的构建：设计引物构建携带有BMAP27信号肽序列的质粒，将信号肽序列插入pEGFP‑C3质粒的EGFP编码基因的起始密码子之后，上游引物为：5’‑GGCGCTGGCCGAGGGCAGCGCTAGTCCCAGCAGCAGTAGCCAAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCAC‑3’，下游引物为：5’‑GAGACCCAGAGGGCCAGCCTCTCCCTGGGACGGTGGTCACTGGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCTC‑3’；以pEGFP‑C3质粒为模板，用PrimeSTAR HS DNA聚合酶进行PCR扩增；扩增产物用Blunting Kination Ligation Kit进行平滑末端连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落测序，以确定SP序列正确插入，测序正确的质粒命名为pEGFP‑C3‑SP；(2)pEGFP‑C3‑SP‑BMAP27载体的构建：以牛中性粒细胞cDNA为模板，PCR扩增BMAP27(序列号：NM_174832)全长编码区序列，并添加EcoR I和Xba I酶切位点，正向引物为5’‑CGGAATTCATGGAGACCCAGAGGGCCAG‑3’，下划线为EcoR I酶切位点；反向引物为5’‑GCTCTAGATTACCCCAAATGGAGTAG‑3’，下划线为Xba I酶切位点；割胶回收BMAP27片段，与质粒pEGFP‑C3‑SP分别进行EcoR I和Xba I双酶切后，使用T4 DNA连接酶将BMAP27片段定向插入pEGFP‑C3‑SP的EcoR I/Xba I位点；重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，阳性克隆进行EcoR I/Xba I双酶切鉴定，并测序，将测序和双酶切鉴定正确的重组质粒命名为pBMAP27；(3)壳聚糖‑质粒DNA纳米粒的制备：配置0.02％质量体积浓度的壳聚糖溶液，用NaOH溶液调节pH值至5.5；配制5mM Na2SO4溶液，将pBMAP27质粒用Na2SO4溶液分别稀释成浓度为75～200μg/mL的溶液，将壳聚糖溶液和质粒DNA溶液分别置于55℃水浴中加热10min，取等体积壳聚糖溶液和质粒DNA溶液迅速混合，涡旋震荡30s，室温静置30min，制备得到壳聚糖/质粒DNA复合物，即载抗菌肽基因的药物递送系统。