[发明专利]一种红叶卫矛多倍体细胞育种技术

摘要

本发明涉及一种红叶卫矛多倍体细胞育种方法，属于植物倍性育种领域，涉及红叶卫矛体细胞诱导培育三倍体植株的方法，包括在无菌培养条件下用红叶卫矛种子的胚乳诱导愈伤组织、游离原生质体并分选出三倍体原生质体、将三倍体原生质体诱导培养形成三倍体植株的过程和方法；还包括三倍体红叶卫矛植株顶芽休眠解除的过程和方法。本发明从红叶卫矛二倍体野生植株种籽胚乳的大量二倍体细胞中分选富集三倍体细胞，培育形成三倍体小植株并促其生长。

主权项

1.一种红叶卫矛多倍体细胞育种方法，其特征在于：a)野生红叶卫矛种子胚伴随的胚乳离体诱导愈伤组织；b)原生质体游离与分选，并培养形成小植株；c)低温与激素联合处理，解除小植株顶芽休眠，其中所述方法中a)的特征在于：种子去除种皮，将胚及胚乳接种在红叶卫矛胚乳愈伤组织诱导培养基上培养4周，胚剥离，胚乳继续培养诱导愈伤组织；其中所述愈伤组织诱导培养基包含基本培养基：MS无机盐、维生素B1 0.1‑1.0mg/L、维生素B6 0.1‑0.5mg/L、烟酸0.1‑0.5mg/L、甘氨酸1.0‑2.0mg/L、水解酪蛋白0.3‑0.6g/L、吗啉乙磺酸0.5‑1.0g/L、蔗糖20‑30g/L；植物生长调节剂：6‑BA 1.0‑3.0mg/L和NAA 0.5‑2.0mg/L；琼脂6‑8g/L；所述方法中b)的特征在于：胚乳愈伤组织在4℃下黑暗处理24小时后，用于游离原生质体,胚乳切片置于红叶卫矛愈伤组织酶解液中4‑8小时；游离红叶卫矛原生质体后，进行Hoechst 33342染色、流式细胞术筛选及低熔点琼脂糖包埋培养，在红叶卫矛不定芽诱导培养基上形成不定芽后，转接至红叶卫矛不定根诱导培养基上形成小植株；其中所述酶解液包含：原生质体洗涤液：KH2P04 20‑27.2mg/L、KNO3 90‑101mg/L、MgSO4▪ 7H2O 180‑246mg/L、KI 0.10‑0.16mg/L、CuSO4 0.010‑0.025mg/L、CaCl2▪ 2H2O 1000‑1480mg/L、甘露醇0.5‑0.7M/L、吗啉乙磺酸5‑25mM/L；细胞壁水解酶：纤维素酶1.0‑2.0％、离析酶0.5‑1.0％、果胶酶0.5‑1.0％；以及HCl 1M/L和NaOH 1M/L水溶液用于调节pH值为5.2‑5.8；其中所述不定芽诱导培养基包含所述基本培养基；植物生长调节剂6‑BA 2.0‑6.0mg/L、IBA 0.1‑0.2mg/L；琼脂0.6‑0.8g/L；其中所述不定根诱导培养基包括：生根培养基I，其包含1/2WPM+硝酸铵0.4‑1.0g/L+蔗糖20‑30g/L+IBA 1.0‑3.0mg/L；和生根培养基Ⅱ，其包含1/2WPM+硝酸铵0.4‑1.0g/L+蔗糖20‑30g/L+活性炭2.0‑4.0g/L；所述方法中c)的特征在于：组织培养小植株在含有植物生长调节剂GA3和6‑BA的生根培养基Ⅱ上，在3‑8℃下暗培养30‑45d，移至25℃，光照36μmol·m‑2·s‑1，16h/d条件下培养解除顶芽休眠。