[发明专利]一种百合WRKY33基因定量检测试剂盒及其检测方法

摘要

一种百合转录调节因子WRKY33基因定量检测的试剂盒及其检测方法，该试剂盒主要包括特异性引物、第一链cDNA合成试剂、荧光定量PCR反应试剂以及阳性对照品和阴性对照品；特异性引物由百合WRKY33基因和内参18S rRNA基因的特异性引物组成；阳性对照品为百合WRKY33基因标准品以及内参18S rRNA基因标准品；阴性对照品为DEPC水；本发明针对百合WRKY33基因提供了一种快速、敏感、特异的定量检测试剂盒和检测方法，为研究百合WRKY33基因与病毒抑制剂或水杨酸等诱导植物抗病性的关系提供了技术支持。

主权项

一种百合转录调节因子WRKY33基因定量检测试剂盒，包括特异性引物、第一链cDNAs合成试剂以及荧光定量PCR反应试剂，所述特异性引物由百合WRKY33基因和内参18S rRNA基因的特异性引物组成，所述特异性引物的序列如下：百合WRKY33基因上游引物P1：5’‑ ATCTTGGCTTCAGGTAACA ‑3’百合WRKY33基因下游引物P2：5’‑GCTCTCTCAACATGCTTTC ‑3’内参18S rRNA基因上游引物P3：5’‑ GGGGAAACTTACCAGGTCCA ‑3’内参18S rRNA基因下游引物P4：5’ ‑CAGACAAATCGCTCCACCAA ‑3’；其特征在于所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为百合WRKY33基因标准品以及内参18S rRNA基因标准品，所述阴性对照品为DEPC水；所述阳性对照品序列如下：百合WRKY33基因标准品：atcttggcttcaggtaacaagacagtgagggagccaagggtggtggtgcagacgacgagcgatatcgatatcctcgatgatggctataggtggaggaagtatgggcagaaggttgtgaaggggaatccaaacccaaggagctactacaagtgcactactgcgagttgcccagtgcgaaagcatgttgagagagc；内参18S rRNA基因标准品：ggggaaacttaccaggtccagacatagtaaggattgacagactgagagctctttcttgattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtctg；其特征在于将上述阳性对照品序列构建到质粒载体中，测定阳性质粒浓度后换算为拷贝数，然后用双蒸水将上述阳性质粒进行10倍梯度稀释，以10倍系列稀释的阳性质粒溶液作为模板，应用上述特异性引物P1、P2及P3、P4分别进行荧光定量PCR扩增，根据拷贝数的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到WRKY33基因和18S rRNA基因的标准曲线；同时将待测样品提取总RNA后进行反转录RT反应，以合成的cDNAs为模板，应用上述特异性引物P1、P2及P3、P4在相同条件下进行荧光定量PCR扩增，测得待测样品cDNAs的Ct值后，对照标准曲线即可获得待测样品起始cDNAs中WRKY33基因和18S rRNA基因的精确拷贝数，再经过内参校正后最终获得待测样品WRKY33基因的标准拷贝数。