[发明专利]一种重组人白血病抑制因子的制备方法

摘要

本发明涉及医药领域，具体为一种应用从大肠杆菌细胞表达产物中制备具有高纯度重组人白血病抑制因子的方法。具体为应用大肠杆菌表达白血病抑制因子蛋白，并且利用低温诱导使白血病抑制因子蛋白呈可溶性表达，之后应用阳离子交换色谱、阴离子交换色谱和阳离子交换色谱三步纯化方法获得的白血病抑制因子蛋白具有高纯度和高活性。本方法具有易操作、成本低等特点，可用于规模制备重组白血病抑制因子。

主权项

1.一种重组人白血病抑制因子的制备方法，包括以下步骤：(1)将Tris‑HCL、NaCl、EDTA混合，混合液中的三者的浓度分别达到20mM、60mM和1mM，然后加入Triton X‑100，使其浓度达到0.5％，得到裂解液；(2)对包含有人白血病抑制因子表达载体的大肠杆菌放入培养基中在37℃进行培养，在OD600nm达到0.6时加入0.5mM的异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷进行诱导，调整大肠杆菌的培养温度至16℃继续培养20小时后收获细菌，加入裂解液后对菌体进行破碎，分离菌体沉淀和上清液，使用NaH₂PO₄溶液调整上清液的pH至6.0；(3)初步纯化：使用配基为磺酸基型的强阳离子类交换色谱填料SP sepharose fast flow填装的色谱柱，以磷酸、NaCl、EDTA按照25mM、50mM和1mM配制缓冲液A，以磷酸、NaCl、EDTA按照25mM、500mM和1mM配制缓冲液B，然后以缓冲液A平衡色谱柱，将获得的上清液进行上样，然后继续使用缓冲液A平衡色谱柱，再以磷酸、NaCl、EDTA按照三者浓度25mM、100mM和1mM配制溶液，加入非离子表面活性剂Triton X‑114，得到含有0.1％非离子表面活性剂Triton X‑114的清洗缓冲液，对结合在填料上的蛋白进行清洗，在基线稳定后应用以缓冲液A和B体积比1:4配制的洗脱缓冲液对结合在层析填料上的蛋白样品进行洗脱，收集洗脱峰，对收集的洗脱峰进行超滤换液处理，将洗脱组分的缓冲液置换为pH 7.0的25mM磷酸缓冲液；(4)中度纯化：使用配基为季胺基型的强碱型阴离子交换色谱填料Q sepharose fast flow填装的色谱柱，以pH 7.0的25mM磷酸缓冲液平衡色谱柱后，将合并后换液的洗脱液组分进行上样，继续使用以pH 7.0的25mM磷酸缓冲液平衡色谱柱，在紫外吸收升高以及回落至20mAU‑200mAU收集流穿的含有样品的组分；(5)精细纯化：使用配基为具有磷酸根基团的阳离子交换色谱填料羟基磷灰石填装的色谱柱，以pH 7.0的25mM磷酸缓冲液平衡色谱柱后，将上述收集的流穿组分上样，再次使用pH 7.0的25mM磷酸缓冲平衡色谱柱，以磷酸、NaCl按照25mM、500mM配制pH 7.0的缓冲液C，之后根据样品纯化的规模线性变换pH 7.0的25mM磷酸缓冲液和缓冲液C的相对比例，应用线性梯度洗脱的方式对结合在填料上的样品进行洗脱，在紫外吸收升高以及回落至20mAU‑200mAU收集洗脱峰组分，得到最终的重组人白血病抑制因子洗脱液。