[发明专利]一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法

摘要

本发明属于生物医药领域，涉及一种特异性禽源单链抗体的制备和应用，具体涉及一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法。一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法，包括以下步骤：(1)犬细小病毒样粒子的免疫；(2)禽源单链抗体的噬菌体抗体库的建立；(3)通过噬菌体展示技术对步骤(2)得到的单链抗体进行筛选，得到特异性抗犬细小病毒单链抗体；(4)基于步骤(3)得到的特异性抗犬细小病毒单链抗体通过原核表达获得禽源基因工程单链抗体。

主权项

一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)犬细小病毒样粒子的免疫(11)选取生产状态良好的60～70日龄未开产母鸡5只；(12)将犬细小病毒样粒子与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对步骤(11)中的母鸡进行初次免疫，免疫剂量为200～1000μg/kg，免疫佐剂为完全弗氏佐剂；(13)初次免疫14天后，对步骤(2)中的母鸡依次进行四次加强免疫，每次加强免疫的间隔时间为14天，加强免疫时，将犬细小病毒样粒子与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对母鸡进行加强免疫，免疫剂量为200～1000μg/kg，免疫佐剂为不完全弗氏佐剂；(2)禽源单链抗体的噬菌体抗体库的建立(21)待步骤(13)中的母鸡五次免疫完成后，收集其脾脏组织，‑80℃储存；(22)使用总RNA提取试剂盒提取步骤(21)得到的脾脏组织的总RNA；(23)对步骤(22)得到的脾脏组织总RNA进行反转录，得到脾脏组织cDNA；(24)使用两对特异性引物以脾脏组织cDNA为模板分别扩增轻链可变区和重链可变区，接着使用重叠聚合酶链式反应组装成禽源单链抗体片段,其中，两对特异性引物包括引物HF‑Sif I、引物HR‑Linker、引物LF‑Linker和引物LR‑Not I，引物HF‑Sif I:5’‑ATGTCTATGGCCCAGCCGGCCGTGACGTTGGACG‑3’；引物HR‑Linker:5’‑CAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGGAGGAGACGATGAC‑3’；引物LF‑Linker:5’‑TTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGCGCTGACTCAGCCGTCCT‑3’；引物LR‑Not I:5’‑AGTTACTGGAGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGGG‑3’；(25)建立噬菌体抗体库(251)将步骤(24)获得的禽源单链抗体片段分别用引物Sif I和引物Not I酶切，再将pCANTAB5E噬菌粒载体分别用引物Sif I和引物Not I酶切；(252)将步骤(251)得到的酶切产物经胶回收后，使用T4‑DNA连接酶将酶切禽源单链抗体片段与酶切pCANTAB5E噬菌粒载体连接在一起；(253)将步骤(252)得到的连接产物转化入TG1大肠杆菌中，并将其涂布于SOB固体培养基上，30℃，培养12‑16小时，其中该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；(254)将步骤(253)中SOB固体培养基上的菌落用5mL 2×YT培养基洗脱下来，加入等体积的50％灭菌甘油，放入‑80℃存储备用；(3)通过噬菌体展示技术对步骤(2)得到的单链抗体进行筛选，得到特异性抗犬细小病毒单链抗体；(4)基于步骤(3)得到的特异性抗犬细小病毒单链抗体通过原核表达获得禽源基因工程单链抗体。