[发明专利]一种芽胞杆菌多基因叠加敲除方法

摘要

本发明公开了一种芽胞杆菌多基因叠加敲除方法，是将芽胞杆菌多个待敲除基因的上下游同源臂基因片段插入到温敏型质粒中，转化芽孢杆菌，通过高温培养迫使芽胞杆菌中的敲除质粒与其基因组DNA发生同源单交换，高温传代培养筛选双交换的菌株。提取多个基因单交换成功菌株的基因组DNA，限制性内切酶消化后，回收DNA片段，转化单基因成功实现无痕敲除的菌株，进行双交换筛选，叠加敲除成功的菌株作为下一轮叠加敲除的宿主菌，依次叠加最终实现芽胞杆菌多基因的敲除。用温敏型质粒实现芽胞杆菌基因的无痕敲除，以单交换的宿主基因组DNA转化芽胞杆菌不仅能提高转化效率，还能有效避免宿主菌中已敲除基因的回复，显著提高多基因叠加敲除效率。

主权项

1.一种芽胞杆菌多基因叠加敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备多种温敏型质粒，每种温敏型质粒含有温敏型复制子、待敲除基因的上下游同源臂片段，以及至少一个抗性基因；不同种温敏型质粒对应不同的待敲除目的基因；(2)多种温敏型质粒同一时间转化由目标芽胞杆菌制备的感受态细胞A，通过抗性培养基筛选出阳性克隆子，对阳性克隆子进行升温至42～44℃高温培养迫使转化进感受态细胞A的质粒与目标芽胞杆菌基因组发生同源单交换以将质粒基因整合到目标芽孢杆菌基因组中；将发生同源单交换的菌株继续在42～44℃培养，每8～12h传代培养一次，至少传代两次，以剔除游离状态的质粒并促进整合后的基因发生同源双交换；挑取传代培养后的菌株在无抗性平板培养基培养繁殖，然后挑取繁殖获得的单菌落，分别点在有抗性和无抗性的培养基平板上进行培养，挑取在抗性培养基平板上不长而在无抗性培养基平板上生长的克隆子，进行PCR验证和测序验证，验证正确的即为成功敲除第1个目的基因的菌株；其中，同一时间转化的多种温敏型质粒所含的抗性基因不同；(3)步骤(2)获得的敲除第1个目的基因的菌株制备感受态细胞B，提取步骤(2)中其余成功发生同源单交换的菌株的基因组DNA，采用特定的限制性内切酶进行酶切，纯化酶切后的基因组DNA片段，同一时间电转化进感受态细胞B，筛选阳性克隆子；阳性克隆子升温到42～44℃的高温培养，迫使转入的基因组DNA片段与感受态细胞B的基因组发生同源单交换；将发生同源单交换的菌株继续在42～44℃培养，每8～12h传代培养一次，至少传代两次，以剔除游离状态的基因组DNA片段并促进整合后的基因发生同源双交换；挑取传代培养后的菌株在无抗性平板培养基培养繁殖，然后挑取繁殖获得的单菌落，分别点在有抗性和无抗性的培养基平板上进行培养，挑取在抗性培养基平板上不长而在无抗性培养基平板上生长的克隆子，进行PCR验证和测序验证，验证正确的即为成功叠加敲除第1个和第2个目的基因的菌株；所述特定的限制性内切酶，仅能切割成功敲除的目的基因的上下游同源臂之间的序列；(4)重复步骤(3)的过程，依次转化酶切处理过的步骤(2)余下成功发生同源单交换的菌株的基因组DNA，筛选，成功叠加敲除第1个、第2个和第3个目的基因的菌株，敲除的菌株作为下一轮叠加敲除的宿主菌，以此类推，最终获得多个基因敲除的菌株。