[发明专利]一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明提供了一种采用淋巴细胞杂交瘤技术制备小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的方法，这个抗体为今后检测人KIAA0100蛋白的表达，研究人KIAA0100蛋白的结构和功能奠定了基础。我们使用本发明中所制备的抗体，采用western blot分析方法检测了U937细胞中人KIAA0100蛋白的表达；采用免疫细胞化学分析方法在世界上首次明确了人KIAA0100蛋白在U937细胞中的亚细胞定位。结果显示：人KIAA0100基因在U937细胞中有两个分子量分别为254kDa和＜250kDa的蛋白产物；在一些U937细胞中,人KIAA0100蛋白主要定位在细胞膜上，在另一些U937细胞中,人KIAA0100蛋白定位在细胞膜和细胞质。综上所述，本发明制备的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体能够高效、特异地识别人KIAA0100蛋白。

主权项

一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：使用生物信息学软件OptimumTMCodon(http://www.genscript.com/codon_opt.html)对人KIAA0100蛋白的蛋白片段(1557‑2234)进行分析，将其对应的核苷酸序列中的大肠杆菌稀有密码子进行优化，在优化后的核苷酸序列的3′端加上6×组氨酸(histidine，His)标签，人工合成核苷酸序列，克隆入pET30a载体中，构建pET30a‑KIAA0100(1557‑2234)质粒表达载体；步骤(2)：pET30a‑KIAA0100(1557‑2234)质粒在大肠杆菌中经诱导表达，获得重组人KIAA0100蛋白片段(1557‑2234)后,使用镍离子‑亚氨基二乙酸(Ni2+charged Iminodiacetic Acidcolumn，Ni2+‑IDA)亲和层析柱纯化；步骤(3)：使用经浓缩和复性后的重组人KIAA0100蛋白片段(1557‑2234)作为免疫原免疫5只健康BALB/c小鼠(雌性，6‑8周龄)，取成功免疫后的小鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞株，以未免疫的、健康BALB/c小鼠(雌性，6‑8周龄)的血清做为阴性对照，使用间接酶联免疫吸附法(enzyme‑linked immunosorbent assay，ELISA)筛选杂交瘤细胞株，使用有限稀释法对筛选出的阳性杂交瘤细胞株进行2轮亚克隆，将ELISA检测阳性的杂交瘤细胞进行扩大培养，最终得到一个稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；步骤(4)：使用SBA小鼠单克隆抗体分析试剂盒(SouthernBiotech，伯明翰,美国)检测获得的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的亚型，使用western blot分析和免疫细胞化学分析对获得的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体进行鉴定；步骤(5)：选择3只健康BALB/c雌性小鼠(6‑8周龄)，每只小鼠腹腔注射0.5ml的姥鲛烷，14天后，腹腔注射杂交瘤细胞，在注射前1天使用新鲜培养基对处于对数生长期的杂交瘤细胞进行换液，注射当天，混匀杂交瘤细胞制成细胞悬液，计数后，将细胞悬液加入15ml离心管中，室温200×g离心5分钟，弃上清后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)(NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na2HPO410mM，KH2PO42mM，PH 7.2‑7.4)悬浮细胞，使细胞浓度为5×106个/ml，每只小鼠注射1ml；观察小鼠的健康状况及腹水产生情况，10天－14天后收集腹水，收集的腹水使用蛋白A亲和层析柱纯化。