[发明专利]1型禽腺病毒疫苗、蛋黄抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种1型禽腺病毒疫苗、蛋黄抗体的制备方法，属于兽用生物制品领域。本发明的1型禽腺病毒疫苗的制备方法包括1型禽腺病毒接种鸡胚肝细胞制备抗原、测定抗原的病毒含量、含量合格的抗原经灭活剂灭活、灭活检验合格的抗原与佐剂混合乳化制备疫苗等步骤。本发明的1型禽腺病毒蛋黄抗体的制备方法包括疫苗免疫产蛋鸡、收集高免蛋、提取抗体、测定效价等步骤。本发明制备的1型禽腺病毒疫苗具有抗原含量高、质量稳定等优点；本发明制备的1型禽腺病毒蛋黄抗体对1型禽腺病毒有很好的预防和治疗效果。

主权项

一种1型禽腺病毒疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将1型禽腺病毒接种鸡胚肝细胞进行培养，待50%‑70%细胞出现细胞病变时收获细胞，即得到1型禽腺病毒抗原；（2）测定1型禽腺病毒抗原的病毒含量，含量不低于10^7.5TCID₅₀/0.1mL的抗原用于后续制备疫苗；（3）1型禽腺病毒抗原经甲醛或二乙烯亚胺灭活后接种鸡胚肝细胞，并盲传若干代，对1型禽腺病毒抗原进行灭活检验判定是否灭活完全；（4）灭活完全的1型禽腺病毒抗原与矿物油佐剂混合，乳化制备疫苗；通过血清学方法或攻毒法检验疫苗效力，检验合格的疫苗即为1型禽腺病毒疫苗；所述的血清学方法包括如下步骤：取3～4周龄SPF鸡10‑20只各颈部皮下注射疫苗0.3mL，另用5‑10只鸡不接种作为对照；接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡，分别采血、分离血清，用微量中和试验法测定血清中和抗体效价；免疫鸡血清中和抗体效价几何平均值不低于1:000‑1:10000，对照鸡血清中和抗体效价不高于1:100，则检验合格；其中微量中和试验法包括如下步骤：1）用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种96孔细胞培养板，用于接种的细胞量为30000‑100000个肝细胞/0.1mL/孔，37℃、5% CO₂培养箱培养24小时，备用；2）将被检样品用细胞维持液做10倍系列稀释；3）1型禽腺病毒用细胞维持液稀释至100‑1000TCID₅₀/0.1mL；4）向步骤2）不同稀释度的样品中加入等体积100‑1000TCID₅₀/0.1mL的1型禽腺病毒，混匀，37℃孵育1小时；5）弃去96孔细胞培养板中的细胞生长液，用步骤（4）孵育得到的各混合液接种96孔细胞培养板，0.2mL/孔，每个稀释度6‑8孔；6）接种后第7日，显微镜下观察96孔细胞培养板，统计各稀释度出现、不出现CPE孔的数量，以Reed‑Muench法计算被检样品中和效价；所述的攻毒法包括如下步骤：取3～4周龄SPF鸡10‑20只各颈部皮下注射疫苗0.3mL，另用5‑10只鸡不接种作为对照；接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡各肌肉注射或滴鼻点眼接种浓度为100‑100000000TCID₅₀/0.1mL的1型禽腺病毒液0.1mL；接种病毒后第5日以棉拭子沾取泄殖腔内容物作为被检样品，采集的棉拭子放入装有0.5‑1.0mL含1000单位/mL青霉素和1000单位/mL庆大霉素的细胞维持液的容器中，进行病毒分离，对照鸡病毒分离为80%‑100%阳性，免疫鸡病毒分离为80%‑100%阴性；或接种病毒后10日内，对照鸡40%‑100%死亡，免疫鸡90%‑100%健活，则检验合格；其中病毒分离的方法包括如下步骤：1）用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种6孔细胞培养板，用于接种的细胞量为1000000‑6000000个肝细胞/2mL/孔，37℃、5% CO₂培养箱培养24小时，备用；2）棉拭子在细胞维持液中多次与容器壁挤压，使病毒粒子释放到细胞维持液中，弃去棉拭子，含有病毒粒子的细胞维持液作为被检样品备用；3）弃去6孔细胞培养板中的细胞生长液，加入2‑3mL细胞维持液，将0.3mL‑0.5mL被检样品加入6孔板的其中一孔，37℃、5% CO₂培养箱培养；4）接种后第7日，显微镜下观察6孔细胞培养板，统计各孔出现、不出现CPE的情况；用间接免疫荧光法检测6孔板中出现的CPE是否是由1型禽腺病毒感染引起的特异性CPE；出现特异性CPE的孔所对应的被检样品病毒分离为阳性，不出现CPE的孔所对应的被检样品病毒分离为阴性。