[发明专利]一种筛选海洋微生物菌株降解虾蟹壳粉制备几丁质的方法

摘要

一种筛选海洋微生物菌株降解虾蟹壳粉制备几丁质的方法，其特征在于：包括如下步骤：产酸微生物菌株的筛选→产酸微生物菌株中产蛋白酶菌株的筛选→同时产酸、产蛋白酶但不产几丁质酶菌株的筛选→降解虾蟹壳粉生产几丁质菌株的筛选→目标菌株16S rDNA的鉴定；由于虾蟹壳粉中碳酸钙、蛋白质和几丁质都是不溶性的，所以单独的一步操作很难筛选到能够降解虾蟹壳粉生产几丁质的微生物菌株，本发明通过几步简单的平板微生物菌落筛选法就能筛选出产目标菌株，方法简单易行，适合从海洋环境筛选降解虾蟹壳粉生产几丁质的菌株。

主权项

1.一种筛选海洋微生物菌株降解虾蟹壳粉制备几丁质的方法，包括如下步骤：产酸微生物菌株的筛选→产酸微生物菌株中产蛋白酶菌株的筛选→同时产酸、产蛋白酶但不产几丁质酶菌株的筛选→降解虾蟹壳粉生产几丁质菌株的筛选→目标菌株16S rDNA的鉴定，其特征在于：具体操作步骤如下：(1)产酸微生物菌株的筛选：培养基I的制备：蛋白胨5克，酵母膏1克，磷酸高铁0.01克，碳酸钙20克，琼脂15‑20克，陈海水1000毫升，pH7.6‑7.8；产酸微生物菌株的筛选：将从不同海域取的海水或海泥使用灭菌的陈海水稀释10^‑1、10^‑2、10^‑3、10^‑4倍，分别将不同稀释度的样品涂布于筛选培养基I的平板上，然后将平板放入25℃培养箱中培养2‑3d，挑选有明显透明圈的菌落，在2216E上三次三区划线，挑取单菌落，即为产酸的微生物菌株；(2)产酸微生物菌株中产蛋白酶菌株的筛选：培养基II的制备：脱脂奶粉5克，蛋白胨5克，酵母膏1克，琼脂粉20克，陈海水1000mL，pH7.0‑7.4；将步骤(1)中筛选到的单菌落利用灭菌牙签点接法接到筛选培养基II的平板上，然后将平板放入25℃培养箱中培养2‑3d，挑选有明显透明圈的单菌落，即为产酸微生物菌株中产蛋白酶菌株；(3)同时产酸、产蛋白酶但不产几丁质酶菌株的筛选：培养基III的制备：几丁质10克，蛋白胨5克，酵母膏1克，磷酸高铁0.01克，琼脂15‑20克,陈海水1000毫升，pH7.6‑7.8；同时产酸、产蛋白酶但不产几丁质酶菌株的筛选：将步骤(2)中筛选到的单菌落进一步利用灭菌牙签点接法接到筛选培养基III的平板上，然后将平板放入25℃培养箱中培养2‑3d，挑选没有明显透明圈的单菌落，即为同时产酸、产蛋白酶但不产几丁质酶菌株；(4)降解虾蟹壳粉生产几丁质菌株的筛选：培养基IV的制备：虾蟹壳粉10克，蛋白胨5克，酵母膏1克，磷酸高铁0.01克，琼脂15‑20克，陈海水1000毫升，pH7.6‑7.8；降解虾蟹壳粉生产几丁质菌株的筛选：将步骤(3)中筛选到的单菌落利用灭菌牙签点接法接到筛选培养基IV的平板上，然后将平板放入25℃培养箱中培养2‑3d，挑选有明显透明圈的单菌落，即为降解虾蟹壳粉生产几丁质菌株；(5)目标菌株16S rDNA的鉴定：目标菌株16S rDNA基因序列的PCR扩增：以菌体为模板，通过细菌通用引物，包括上游引物Eubac 27F：5‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3和下游引物Eubac 1492R：5‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3，在聚合酶的作用下，经预变性、变性、退火、延伸、30个循环、延伸、获得目标菌株的16S rDNA基因序列；目标菌株16S rDNA的鉴定：1％的琼脂糖电泳检测PCR反应产物，并把所得的16S rDNA基因序列与GenBank数据库中进行Blastn序列比对。