[发明专利]一种固定化酶制备唾液酸的方法

摘要

本发明公开了一种固定化酶制备唾液酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明对蚕丝脱胶后溶解在碳酸钠溶液中，并透析、干燥得蚕丝蛋白，蚕丝蛋白和异构化酶、唾液酸醛缩酶交联固化得固定化酶，将固定化酶与脱脂后的乳清液混合，酶催化反应得酶解液，离心分离得上清液，醇沉后得唾液酸粗品，重新溶于去离子水中去除不溶杂质后用膜过滤，最后冷冻干燥得唾液酸产品。本发明反应条件温和，在整个制备的过程中对环境污染小，提取效率高，操作工艺简单、新颖，本发明所制得的唾液酸在收率和产品质量方面均获得了极好的结果，收率高达80％以上，纯度高达98％以上，得到的唾液酸可广泛应用于化妆品、药物以及其他生物医药技术领域。

主权项

一种固定化酶制备唾液酸的方法，其特征在于具体制备步骤为：（1）收集150～200g蚕茧，抽丝后将其按固液比1:5与浓度为3～4g/L的角蛋白酶溶液混合，混合后用质量分数25%草酸溶液调节pH至4.0～5.0，调节后对混合液加热至80～90℃，保温脱胶1～2h，抽滤得滤渣，再将滤渣按固液比1:5与质量分数25%氢氧化钠溶液混合，（2）加热至75～85℃，保温脱胶30～50min，脱胶完成后抽滤并收集脱胶蚕丝，用去离子水冲洗3～5次后放入烘箱中，在90～100℃下干燥3～5h，得脱胶蚕丝；（3）将上述脱胶蚕丝粉碎、过筛得100～120目粉末，将其按固液比1:60与质量浓度2%碳酸钠溶液混合，放入70～80℃的水浴锅中，搅拌溶解30～40min，将溶解液注入截留分子量1200～1500的透析袋中，用蒸馏水流动透析3～4h，透析过滤，去除杂质，用旋转蒸发仪去除60～80%水分，将剩余液体冷冻干燥，即蚕丝蛋白固体；（4）分别称取3～5g上述蚕丝蛋白固体、0.2～0.5g异构化酶、0.1～0.3g唾液酸醛缩酶和800～1000mL质量分数20%戊二醛溶液，在4℃下在恒温摇床中以200～300r/min转速下进行振荡1～2h，振荡后放入4℃冰箱中静置固化15～20h，固化后分别用浓度为0.05mol/LTris‑HCl缓冲液和去离子水洗涤5～7次，洗涤后抽滤，冷冻干燥即可得到固定化酶粉末；（5）称取100～200g乳清，将其按固液比1:3与40℃温度的水混合，搅拌混合至乳清完全溶解，将液体按体积比1:1与氯仿混合，搅拌20～30min后在2000～3000r/min转速下离心分离10～15min，得脱脂上清液，向脱脂上清液中加入总质量3～5%上述制得的固定化酶粉末，在50～60℃下酶催化反应5～6h；（6）上述酶催化反应结束后，得酶解液，在5000～6000r/min转速下离心分离得上清液，并将上清液冷冻干燥得固体，按固液比1:20与无水乙醇混合，搅拌20～30min后离心分离，得沉淀物，将沉淀物按固液比1:5加入去离子水中，搅拌溶解，过滤去除不溶物，将溶液用截留分子量在5000～10000的膜过滤，收集透过液，并冷冻干燥即可得唾液酸产品。