[发明专利]一种高纯度经血来源干细胞的制备方法

摘要

本发明提供一种高纯度经血来源干细胞的制备方法：使用经血采集套装收集经血；收集中间层单个核细胞；加入磁珠缓冲液，充分混匀后加入FcR试剂，孵育后再加入交联抗人抗体的微磁珠试剂，混匀后孵育；再加入磁珠缓冲液，洗涤、离心后重悬于磁珠缓冲液中；加入到预先放置于磁性分选架的分选柱中，使用磁珠缓冲液冲柱洗涤；将分选柱取出，加入1.5‑2ml磁珠缓冲液，收集细胞悬液；将所得悬液用经血干细胞原代培养基培养，每2‑3天半量换液一次；培养5‑7天后消化收集贴壁细胞，用经血干细胞传代培养基继续扩增培养；消化所得细胞，加入冻存液进行冻存。该方法获得的经血来源干细胞纯度高，生长周期短，自我更新能力强、污染率低。

主权项

一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：(1)使用经血采集套装，将经血收集到含抗生素保存液的经血采集管中，抗生素保存液与经血的混合比例为(1‑1.5):1，2‑8℃下低温保存，保存期≤72小时；(2)将经血采集管离心，弃去上清液，收集细胞沉淀；(3)将细胞沉淀与生理盐水按1:(1‑1.5)的体积比充分混合后，缓慢加入到等体积的淋巴分离液界面上，离心，收集中间层单个核细胞，然后生理盐水洗涤、离心；(4)将获得的单个核细胞取样计细胞数，每1×108细胞：加入100‑200μl磁珠缓冲液，充分混匀后加入50‑100μl FcR试剂，2‑8℃孵育5‑10分钟后再加入50‑100μl交联抗人抗体的微磁珠试剂，混匀后在2‑8℃孵育10‑20分钟；(5)步骤(4)所得液体再加入1‑1.5ml的磁珠缓冲液，洗涤、离心后重悬于磁珠缓冲液中，细胞悬液的浓度为1×108细胞/ml；(6)将上述细胞悬液全部加入到预先放置于磁性分选架的分选柱中，使用磁珠缓冲液冲柱洗涤；(7)将分选柱取出分选架，放置于无菌收集管中，加入1.5‑2ml磁珠缓冲液，收集细胞悬液；(8)将所得悬液取样计细胞数，用经血干细胞原代培养基稀释后按5000‑7000细胞/cm2的密度接种到细胞培养瓶中，放置于37℃、5％CO2培养箱培养，每2‑3天半量换液一次；(9)细胞培养至5‑7天后，倒置显微镜下观察细胞已达到70‑80％密度，消化收集贴壁细胞，按3000‑5000细胞/cm2的密度接种到细胞培养瓶，用经血干细胞传代培养基继续扩增培养；(10)将消化所得的细胞混合于2‑8℃预冷的经血干细胞冻存液中，并加入到冻存管中，细胞密度为0.1‑1×107细胞/ml，放入冻存盒，于‑80℃冰箱放置12‑24小时后转入‑196℃液氮冻存。