[发明专利]一种低温嗜盐α—淀粉酶的基因克隆、表达及分离纯化方法

摘要

本发明提供了一种低温嗜盐α—淀粉酶的基因克隆、表达及分离纯化方法。通过提取该金属硫蛋白基因，设计引物TAC‑F7、TAC‑R5，经PCR扩增后与表达载体进行连接，构建重组质粒；将重组质粒转化入表达菌株，构建重组基因工程菌；建立了该重组蛋白的表达与纯化方法。其低温嗜盐α—淀粉酶核苷酸序列及编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，其信号肽的基因和氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。该淀粉酶具有如下性质：最适温度20℃，最适pH 8.0，最适盐浓度为1M NaCl；作为一种新型的低温嗜盐酶制剂，可有效的用于食品、发酵、医药、皮革、酿造、饲料、纺织和洗涤剂等工业中。

主权项

一种低温嗜盐α‑淀粉酶的基因克隆与表达方法，其特征为，包含如下步骤：(1)引物的设计与合成：根据测序所得的低温α‑淀粉酶基因序列，设计的引物为：上游TAC‑F7：5’CGCGGATCCAAAACCTTTACTTTGAGTGC 3’下游TAC‑R5：5’CCGCTCGAGCAGTGTGTTATTTAGCAAC 3’；引物分别带有BamH I和Xho I两种酶的酶切位点和三个保护碱基，上游TAC‑F7的酶切位点为“GGATCC”，下游TAC‑R5的酶切位点为“CTCGAG”；(2)目的基因的扩增：提取Pseudoalteromonas sp.AN175细菌基因组DNA；以细菌基因组DNA为模板，利用引物TAC‑F7、TAC‑R5来扩增目的基因；(3)重组质粒的构建：利用BamH I与Xho I两种限制性内切酶对PCR回收产物以及表达载体进行双酶切，并对酶切产物进行纯化回收；将酶切后的目的基因及表达载体的纯化产物进行连接；(4)重组基因工程菌的构建：将重组质粒转化表达菌株的感受态细胞，并筛选阳性克隆，进行菌落PCR和测序鉴定；(5)低温淀粉酶基因的诱导表达：①将含重组质粒的单菌落接种于含卡那霉素的50mL LB液体培养基的250mL钳形瓶中，37℃过夜培养；②取5mL过夜的菌液于装有含卡那霉素的250mL LB液体培养基的500mL锥形瓶中，200r/min振荡培养至OD600值约为0.6时，在诱导瓶中加入100mM IPTG至终浓度0.7mM，37℃摇床培养诱导表达；④将生长良好的含有淀粉酶基因的发酵细菌的全部菌液进行离心处理，将离心的菌体加入适量二氧化硅和6mL预冷的50mM pH 7.0磷酸缓冲液，置于冰水中进行超声破碎；收集上清液和沉淀并用8M尿素溶解沉淀；(6)目的蛋白的纯化：采用凝胶层析及镍柱亲和层析两步法进行目的蛋白纯化，200mM咪唑的缓冲液洗脱目标蛋白，通过SDS‑PAGE电泳检测，获得纯化的低温嗜盐α‑淀粉酶。