[发明专利]一种二倍体草莓的转基因培养基及其转基因方法

摘要

本发明公开了一种二倍体草莓的转基因培养基及其转基因方法，该转基因培养基包括：二倍体草莓种子培养基S1、二倍体草莓共培养培养基S2、二倍体草莓筛选培养基S3；该转基因方法包括：(1)菌种活化，(2)二倍体草莓转基因；本发明建立了一个高效、快速、稳定二倍体草莓转化体系，外植体采用叶片和叶柄，将材料最大程度的应用，提高了提高二倍体草莓转基因转化效率，转化率可达到50％以上；并且能够解决传统农杆菌介导法中的步骤繁杂，容易污染的问题，为进一步应用遗传转化方法改良草莓品种提供实践基础，有利于今后草莓分子育种工作的发展，本发明转基因方法操作过程简单，转化效率高，试验周期短，耗费人力物力较小。

主权项

1.一种二倍体草莓的转基因培养基的转基因方法，其特征在于，包括如下步骤：/n（1）菌种活化：/n将含质粒pK7WG2D农杆菌EHA105在LB固体培养基上划线，25-30 ℃培养1-3天；/n挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50 mL LB液体培养基中，25-30 ℃，200-250rpm 在摇床中振荡培养至OD600值0.3-0.5；/n常温下，4000-6000rmp离心7-9 分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，将上清液去除，重悬菌体，在摇床中振荡培养，测定OD600值为0.1-0.3，制得活化好的菌液；/n（2）二倍体草莓转基因/n材料处理：二倍体草莓种子种植于S1培养基上，长出叶片后在无菌条件下将叶片完全剪下，用手术刀延叶脉横切；同时将草莓叶柄切成0.5-1.5厘米长段，在叶柄上面用手术刀刻伤；/n侵染：将切好的叶片和刻伤的叶柄直接放入活化好的菌液侵染，过程中轻微摇匀，浸染30-40 分钟；侵染完成后将叶片和叶柄取出，直接放置于共培养培养基S2上，使叶片和叶柄伤口与培养基充分接触，在培养室中23-27 ℃，暗培养2-4天，将叶片叶柄转入筛选培养基S3上培养18-22天，二倍体草莓叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进行观察，一部分愈伤有非常亮的绿光发出，一部分没有发光；将发绿光的抗性愈伤保留下来，经过35-45天的培养以后，分化出抗性植株；此时再进行一次荧光检测，将整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉；抗性植株生长55-65天再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄以及根都发亮绿光的可以确定为转基因植株；/n二倍体草莓种子培养基S1：2.0-2.5g/L MS、15-25g/L蔗糖、0.2-0.5mg/L 6-BA、0.0.5-0.15mg/L NAA、5.0-6.0 g/L琼脂粉，pH5.5-6.0；/n二倍体草莓共培养培养基S2：4.2-4.6 g/LMS、25-35g/L蔗糖、0.2-0.4mg/L ZT、0.4-0.6mg/L TDZ、0.05-0.15mg/L IBA、5.0-6.0 g/L琼脂粉，pH5.5-6.0；/n二倍体草莓筛选培养基S3：4.2-4.6 g/L MS、25-35g/L蔗糖、0.2-0.4mg/L ZT、 0.4-0.6mg/L TDZ、0.05-0.15mg/L IBA、 5.0-6.0 g/L琼脂粉、10-30mg/L卡那霉素、300-500mg/L羧苄青霉素、pH5.5-6.0。/n