[发明专利]通过Clonostachys sp.发酵转化荷包牡丹碱为(4S,6aR)-4-羟基荷包牡丹碱的方法

摘要

本发明公开一种通过Clonostachys sp.发酵转化荷包牡丹碱为(4S,6aR)‑4‑羟基荷包牡丹碱的方法,特别是通过微生物发酵转化中药材成分和化合物的手段完全转化荷包牡丹碱为(4S,6aR)‑4‑羟基荷包牡丹碱的方法。即：中药材地不容和化合物荷包牡丹碱经Clonostachys sp.发酵，经过合适的溶剂超声提取，过滤，浓缩后，结合TLC薄层层析法以及高效液相色谱法，可检测到大量的(4S,6aR)‑4‑羟基荷包牡丹碱的产生。(4S,6aR)‑4‑羟基荷包牡丹碱具有与荷包牡丹碱相同水平的抗肿瘤活性，但水溶性提高了近1800倍。本方法具有高效的，创新性的，反应条件温和的，绿色无污染的，易扩大化生产的，操作设备简单的大量转化荷包牡丹碱为(4S,6aR)‑4‑羟基荷包牡丹碱的方法。

主权项

一种通过Clonostachys sp.发酵转化荷包牡丹碱为(4S,6aR)‑4‑羟基荷包牡丹碱的方法，其特征在于固体发酵地不容转化按如下步骤进行：(1)将拟用微生物Clonostachys sp.首先进行活化，即将Clonostachys sp.接种到经过121℃高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3‑7d后，置于4℃冰箱中；(2)将活化的菌种接到PDB种子培养基中，于恒温摇床中培养3‑7d；(3)取干燥的地不容药材粉碎后，取适量的药材粉末置于锥形瓶中，加入自来水浸润后，观察药材的湿润度；将装有药材的锥形瓶加塞包装后置于121℃高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将药材冷却；(4)将步骤(2)的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤(3)前处理的地不容上，加塞包装后置于培养箱中培养5‑30d后取出。(5)经微生物Clonostachys sp.发酵前后的地不容经过甲醇溶液超声提取、过滤和浓缩得到粗提物；分别分离粗提物得到的荷包牡丹碱和(4S,6aR)‑4‑羟基荷包牡丹碱的结构式如下：(6)经TLC薄层层析法检测，分别与原药材进行对照。然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇(20:1)，然后经分离得到的化合物上凝胶柱纯化，通过¹H‑NMR，¹³C‑NMR以及HR‑ESI‑MS鉴定得到化合物结构。