[发明专利]一种高均一度大分子量Levan型果聚糖的制备方法

摘要

本发明公开了一种高均一度大分子量Levan型果聚糖的制备方法，利用现代分子酶工程技术对果糖基蔗糖转移酶进行分子改造，获得果糖基蔗糖转移酶突变体H280R，成功在大肠杆菌中进行原核表达，通过对表达的蛋白纯化，将纯化的酶与底物蔗糖反应，经乙醇沉淀得到Levan型果聚糖样品。本发明采用的果糖基蔗糖转移酶突变体H280R制备Levan型果聚糖时，底物蔗糖的浓度可以达到40％，通过凝胶色谱法确定了其分子量的大小为2×10⁶Da，属于大分子多糖，且Levan型果聚糖均一性好，分散度为2.06，优于目前生物法制备Levan型果聚糖。

主权项

一种高均一度大分子量Levan型果聚糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)构建果糖基蔗糖转移酶突变体H280R设计利用引物F：H280R为5'‑CTCTTTACGATCAGCCGTGATTCGACTTATG‑3'，引物R：H280R为5'‑CATAAGTCGAATCACGGCTGATCGTAAAGAG‑3'，并以质粒pET‑32a‑lev为模板，根据Dpn I法定点突变的反应原理，构建果糖基蔗糖转移酶突变体H280R，设定PCR程序；PCR扩增反应体系为：10μL Primer STAR Max，1μL引物F：H280R，1μL引物R：H280R，2μL模板pET‑32a‑lev，反应总体积为20μL；PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s；54℃褪火30s；72℃延伸3min45s；共进行30个循环反应；然后于72℃继续延伸10min；PCR产物验证、回收后，经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切消化，克隆到PGEX‑4T‑1质粒，转入E.coli BL21(DE3)；(2)果糖基蔗糖转移酶突变体H280R的表达与纯化将步骤(1)中构建好的含有的果糖基蔗糖转移酶突变体H280R的野生型和突变型重组菌株的菌液，分别转接到含有一定浓度氨苄青霉素的200ml液体LB培养基中，37℃培养3～4h，当OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.2～0.5mmol/L的诱导剂IPTG，在28℃的温度下诱导培育4h左右，并在12000rpm的转速下离心5min收集菌体，利用向沉淀中加入细胞裂解缓冲液，并在冰上超声破碎2min至菌液澄清，再将离心管放入转速为12000rpm、温度为4℃的离心机中，离心10min，取上清移至另一干净离心管；重组菌株经诱导剂IPTG培养过夜后收集湿菌体，破碎收集含有果糖基蔗糖转移酶的粗酶液，然后将粗酶液加载到含目His标签的纯化柱中，通过含有20mmol/L的PB、500mmol/L的NaCl和20mmol/L的咪唑缓冲液I和含有20mmol/L的PB、500mmol/L的NaCl和500mmol/L的咪唑缓冲液II，缓冲液I和缓冲液II的酸碱度pH为7.4，进行梯度洗脱，层析结束后对洗脱的收集液，进行SDS‑PAGE验证；(3)酶法合成制备Levan型果聚糖将步骤(2)中纯化的果糖基蔗糖转移酶与25～40％浓度的蔗糖反应，添加pH为6.0的柠檬酸缓冲液，保持反应的温度为40～50℃，反应时间为48h，利用sevag法去除蛋白，加入三倍体积于果糖基蔗糖转移酶反应液的酒精，在4℃低温条件下使多糖沉淀并收集沉淀，再利用浓度为60～80％的乙醇溶液洗涤两次后，将沉淀再用三级水溶解收集，经冻干机冷冻获得粉末状的Levan型果聚糖。