[发明专利]一种猪嵴病毒的培养方法

摘要

本发明公开了一种猪嵴病毒的培养方法，用MDCK细胞成功地对猪嵴病毒进行分离培养，并进行了传代，成功获得了可以用于猪嵴病毒分离传代的细胞系，利用PCR方法证实了其传代培养分离病毒的效果，首次提出了一种能用于猪嵴病毒培养的细胞系，具有一定的创新性。

主权项

1.一种猪嵴病毒的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1复苏MDCK细胞后，连续传代若干次，待细胞状态良好；S2将带有猪嵴病毒的粪便样品稀释，离心，离心后的上清过滤到无菌离心管中，即为接种病毒液；S3将鹅脱氧胆酸CDCA用无水乙醇稀释，‑20℃保存备用；S4进行猪嵴病毒接种前1天，将步骤S1得到的MDCK细胞在细胞培养瓶中再次进行细胞传代，细胞数量以第二天接种时细胞铺满所述细胞培养瓶的底部达90％的为准；S5对步骤S4中最终得到的MDCK细胞利用步骤S2的接种病毒液进行接种病毒，接种时细胞呈单层铺满状态且长势良好：5.1)先弃去步骤S4中的细胞培养瓶中原有的培养液，用1×PBS洗细胞表面然后除尽残留的PBS，然后将用1×PBS洗细胞表面并除尽残留的PBS的细胞分为实验1组、实验2组和对照组；5.2)分别将1mL步骤S2所得的接种病毒液轻轻加入到实验1组和实验2组细胞表面，然后盖上瓶塞，轻轻摇晃瓶子，让接种病毒液在细胞面上来回几次，使病毒在细胞上均匀吸附；在对照细胞中，加入1mL维持液；5.3)将实验1组和实验2组的细胞和对照组细胞一起放入37℃的CO₂培养箱培养1h；其中每隔20min，轻轻摇晃细胞瓶，使病毒液或维持液能充分接触细胞；5.4)吸弃实验1组和实验2组的病毒液以及对照组的维持液，然后在实验1组加入8mL FBS浓度为2％的维持液和浓度为50μM的步骤S3制得的CDCA80μL，实验2组中加入8mL FBS浓度为2％的维持液，对照组加入8mL FBS浓度为2％的维持液，然后实验1组、实验2组和对照组在37℃CO₂培养箱继续培养；5.5)每天观察实验1组、实验2组的细胞病变情况，当90％的细胞出现CPE时即可收集对应实验组的病毒液；5.6)对于实验1组和实验2组，步骤5.5)中收集得到病毒液分装保存在2mL离心管，在12 000g离心3min，以此除去细胞碎片，收集离心后的上清液，用于病毒的传代培养和病毒的检测；5.7)猪嵴病毒在MDCK细胞上连续传50代。