[发明专利]一种基于DSE快速扩繁建立DSE-植物共生体系的方法

摘要

本发明属于微生物学、植物营养和生态学领域，具体涉及一种基于DSE快速扩繁建立DSE‑植物共生体系的方法。本发明选择蛭石、珍珠岩、豆粕和麸皮的混合物为培养基质，添加经改进的MMN培养液为营养液，对DSE进行快速扩繁，获得含有DSE孢子、菌丝体的菌剂，进而通过接种含有大量DSE孢子和菌丝的菌剂实现快速建立DSE‑植物共生体系的目的；采用本发明所述方法建立DSE‑植物共生体系的时间短、成功率高、效果好，可用于DSE形态学研究、鉴定以及DSE与植物的互作研究等等。

主权项

一种基于DSE快速扩繁建立DSE‑植物共生体系的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）DSE快速扩繁：将DSE菌株接种到PDA培养基上，置于25℃培养箱内暗培养活化2周，用Φ5 mm打孔器沿菌落边缘打取DSE菌饼；将DSE菌饼接种至扩繁培养基中，混合均匀，置于25℃培养箱内暗培养2周，每隔48 h摇瓶振荡一次；采用稀释平板法检测DSE有效繁殖体数量，当DSE有效繁殖体数量≥50 CFU/g 时即得到DSE接种剂，备用；所述扩繁培养基包括改进的MMN培养液和培养基质，所述培养基质为蛭石、珍珠岩、豆粕和麸皮按照体积比为3：2：1：1的比例混合而成的混合物，所述改进的MMN培养液和培养基质的体积比为2：5；所述改进的MMN培养液为：葡萄糖15 g，麦芽浸粉15 g，CaCl2 0.05 g，MgSO4 0.15 g，NaCl 0.025 g，FeCl3 1wt%、1.2 mL，KH2PO4 0.5 g，硫胺素100 μg，(NH4)2HPO4 0.25 g，柠檬酸0.2 g，蒸馏水1000 mL，pH 5.5；（2）无菌植物幼苗的培养：将种子用70％乙醇消毒50 s，用0.1%HgCl2消毒7 min，然后用无菌水冲洗3次，将消毒后的种子转移到含有MS固体培养基的培养瓶中25℃培养，待种子萌发形成幼苗时，挑选生长一致的幼苗作为无菌植物幼苗，备用；（3）DSE‑植物共生体系的建立：将DSE接种剂接种至共生培养基中，充分混合后再接入无菌植物幼苗，用无菌的PVA膜封口，置于光照培养箱内培养2周；所述共生培养基包括MS培养基和蛭石，所述MS培养基和蛭石的质量比为3：10；（4）DSE‑植物共生体系的检测：2周后，将植物幼苗从共生培养培养瓶中取出，用蒸馏水冲洗根系，放入10% KOH溶液中，90℃水浴条件下解离30 min，然后经1%盐酸酸化、0.05%曲利苯蓝染色、乳酸甘油脱色后于显微镜下镜检观察根系中DSE的定殖情况，当部分根段看到DSE的深色或蓝色有隔菌丝和典型特征“微菌核”时，表明 DSE‑植物共生体系建立成功。