[发明专利]一种抗人肺炎支原体P30蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒

摘要

本发明涉及一种抗人肺炎支原体P30蛋白抗体及应用该抗体检测人肺炎支原体的免疫层析试剂盒，抗人肺炎支原体P30蛋白抗体是识别人肺炎支原体P30蛋白142‑155位氨基酸所组成的线性抗原表位的抗体，人肺炎支原体P30蛋白在GenBank序列号是ABR09215.1；人肺炎支原体P30蛋白142‑155位的氨基酸序列为AHAEAEVEPAPQPV。本发明所提供的兔抗人肺炎支原体P30蛋白抗体具有特异性好、纯度高、效价高、制备成本低廉的特点。

主权项

1.一种基于抗人肺炎支原体P30蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒或基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒；/n抗人肺炎支原体P30蛋白抗体是AbP30Linear，AbP30Linear的制备方法是：/n1）经结构生物学分析及相关实验研究后，选定人肺炎支原体P30蛋白142-155位的14个氨基酸作为制备兔抗人肺炎支原体P30蛋白抗体的线性抗原表位，该段氨基酸序为AHAEAEVEPAPQPV,将此序列命名为P30Linear；/n2）将步骤1）所述的氨基酸序列P30Linear的N端添加一个半胱氨酸后，用多肽自动合成仪合成多肽并纯化，纯化后的多肽与载体蛋白KLH偶联，形成P30Linear-KLH复合蛋白；/n3）将步骤2）所合成的复合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多点注射，先后注射三次，每次间隔7-10天；/n4）第三次注射10-12天后，收集、分离得到含有兔抗人肺炎支原体P30蛋白抗体的血清，ELISA检测血清中兔抗人肺炎支原体P30蛋白抗体的效价，所述的兔抗人肺炎支原体P30蛋白抗体的效价均在1：60000以上；/n5）将步骤2）合成并纯化的多肽与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联，形成多肽亲和层析柱；/n6）将步骤4）获得的含有兔抗人肺炎支原体P30蛋白抗体的血清加入到步骤5）制备的亲和层析柱中，并在4℃孵育过夜后，洗脱抗体，得到兔抗人肺炎支原体P30蛋白抗体；经SDS-PAGE鉴定其纯度均在97%以上，将这种纯化的抗体命名为AbP30Linear；/n试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒时，所述试剂盒的制备方法是：/n1）量子点标记抗体AbP30Linear：/n向微量离心管中依次加入0.4 nmol羧基水溶性量子点和800 nmol碳二亚胺EDC，以MES缓冲液定容为1 ml，混合溶液，37℃反应5 min后，再加入0.34 mg的制备得到的抗体AbP30Linear，避光反应2 h，加入单端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至终浓度为1%m/v，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1 h；反应后的样品用超滤管离心，6500g离心5min，至体积200ul，将超滤后样品转移至普通EP管内，离心除团聚，得到上部清液以及下部沉淀，10000g条件下离心3min；将上部清液加到分离柱Superdex-200上纯化，待上部清液自然流入柱体中，然后用PBS冲洗，用紫外光照射柱体观察样品的位置，待样品开始从下部流出时开始收集，收集1 ml后停止收集；将纯化后的样品用超滤管以6500g离心浓缩至200ul后转移至普通EP管内离心除团聚，对普通EP管进行离心的条件是10000g，3min；获取上清后以磷酸盐保存液稀释200倍，4℃保存备用；至此制得含有量子点标记抗体AbP30Linear的溶液；/n所述MES缓冲液中各组分含量分别是：10.66 g/L MES以及0.74 g/L EDTA，所述MES缓冲液的pH 7.4；/n所述磷酸盐保存液的制备方式是称取0.29 g磷酸氢二钠、0.0295 g磷酸二氢钠、0.2 g氯化钠、1 g牛血清白蛋白BSA以及0.1 gNaN