[发明专利]一种大鼠肝窦内皮细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开了一种大鼠肝窦内皮细胞的分离培养方法，在分离步骤开创性地使用活检针营造了一个消化腔，形成了一个完全在肝脏内部的消化腔，消化稳定高效，且污染率低；本发明杜绝了胰酶的使用，改为使用多种酶的组合，最大化的保护的细胞；同时在消化液中加入了内皮因子、肝素等不利于肝脏实质细胞生长但有利肝窦内皮细胞生长的组分，在细胞分离的步骤即开始了实质细胞和肝窦内皮细胞的筛选；同时本发明的分离培养方法自始至终均无需吹打，最大限度地保护了肝窦内皮细胞的活力，使得培养得到的细胞活率高，活性好；本发明具有较大的推广意义，为以肝窦内皮细胞培养为基础的相关研究提供了良好的细胞培养解决方案。

主权项

一种大鼠肝窦内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：肝脏的预处理清理离体的大鼠肝脏，并利用含双抗和两性霉素B的D‑hanks溶液冲洗；步骤2：构造消化腔使用活检针刺入步骤1处理后的肝脏，切取部分表面肝脏组织，丢弃，形成消化腔入口；更换活检针，通过消化腔入口，以不同角度多次切取内部肝实质组织并丢弃，造成肝脏内部的消化腔；步骤3：复合消化使用注射器将复合酶消化液从消化腔入口注入消化腔进行消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶，同时还包括1％内皮因子、4uM/ml的L‑谷氨酰胺以及90U/ml的肝素；复合消化的条件为4摄氏度，复合消化时间为4‑12h；步骤4：分离培养肝窦内皮细胞使用注射器将消化腔内消化完毕的细胞液吸出，过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到混合细胞液，在37℃5％CO₂的培养箱中进行培养，所使用的培养基中包括1％内皮因子、1％青链霉素、5％胎牛血清、4uM/ml的L‑谷氨酰胺以及90U/ml的肝素。