[发明专利]与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记及应用

摘要

本发明公开了与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记及应用。通过苗期对资源霜霉病的抗性鉴定筛选的原则和现有技术基础，通过选用高抗霜霉病的甜瓜资源PI438685为高抗资源，以高抗资源PI438685与感病农家品种“卡拉克赛”构建甜瓜霜霉病抗感F₂代群体，利用公知的遗传软件，找到与PI438685抗霜霉病基因连锁的分子标记SSR‑666₂₃₀，该标记与抗病基因的遗传距离为2.66cM。通过提取甜瓜单个植株基因组DNA，用SSR‑666₂₃₀这个标记进行PCR扩增，检测是否只有唯一特定230bp特异性条带出现，如只有这条特异性条带出现，则预测此甜瓜单株抗霜霉病，达到选育抗霜霉病品系过程缩短育种周期、提高选择准确率良好的技术效果，具有广泛的实用价值。

主权项

1.一种与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记SSR‑666₂₃₀的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以感病农家品种“卡拉克赛”为母本，抗病资源PI438685为父本进行杂交，得到杂种F₁；(2)由杂种F₁自花授粉获得F₂代群体，F₁与“卡拉克赛”杂交获得回交群体BC_S，F₁与PI438685杂交获得回交群体BC_r；(3)分别在苗期对PI438685、“卡拉克赛”、F₁、BC_S、BC_r和F₂进行霜霉病抗病性鉴定；霜霉病抗病性鉴定中，接种分别选用PI438685、“卡拉克赛”和F₁各40粒，BCr和BCs各60粒，200粒F₂播种于常见的大棚内的消毒营养钵中，待第2片真叶完全展开时，采用喷雾法进行接种，接种浓度为5×10³个/mL，将配制好的霜霉病菌液均匀喷于整株叶面，接种后黑暗保湿48小时，控制温度夜间20℃白天25℃，相对湿度90％以上；根据在苗期对PI438685、“卡拉克赛”、F₁、BC_S、BC_r和F₂进行抗病性鉴定结果：甜瓜抗霜霉病资源PI438685携带霜霉病抗性基因，抗性基因表现为隐性遗传，PI438685全部抗病，“卡拉克赛”全部感病，F₁、BC_S全部感病，BC_r抗感比接近1:1，F₂中抗感比接近1:3，表明抗源PI438685抗性基因为单基因隐性；(4)抗感基因池的构建：F₂代中选取极端抗病和极端感病的单株各5株，等量的基因组DNA分别混合构建抗感基因池；具体先选取表现型为0级抗病的5个单株，吸取等量的基因组DNA，构建抗病基因混合池，再选取表现型感病的5个单株，吸取等量的基因组DNA，构建感病基因混合池，抗感池最终浓度100ng/mL；(5)利用公知引物公布的信息，分别以抗感基因池为模板进行PCR扩增，经过6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，只有3对引物SSR‑666、SSR‑689和SSR‑699在抗感基因池之间能稳定扩增出多态性条带，所述3对引物SSR‑666、SSR‑689和SSR‑699的引物序列为：SSR‑6665'GTTCCAATTGGGGAGATG'3，5'CAAATCCAACGATTCATAAAC'3；SSR‑6895'TGTGTGTGTGAGAGAGAGAG'3，5'GTGTTTGCCGATTCTACC'3；SSR‑6995'CAATCGCAGATACTTCCACG'3，5'TGCTTGTCCCAACGGTGTCAT'3；(6)通过对已获得3对引物SSR‑666、SSR‑689和SSR‑699做进一步验证；以抗病资源PI438685、感病自交系“卡拉克赛”、F₁以及用于构建抗感基因池的5个抗病F₂单株和5个感病F₂单株为模板进行PCR验证，最终引物SSR‑666扩增稳定，重复性好，在抗亲、抗病基因池和抗病单株上均能扩增出230bp的片段，在感亲、感病基因池和感病单株上没有出现这条特异性条带，说明引物SSR‑666与抗源PI438685的抗霜霉病基因存在连锁关系，命名SSR‑666₂₃₀；(7)根据已获得的分子标记SSR‑666₂₃₀，对F₂代群体单株扩增检测，并进行遗传连锁分析；用遗传软件进行遗传连锁性分析，以3.0为最小LOD阈值，确定甜瓜PI438685霜霉病抗性基因与分子标记SSR‑666₂₃₀紧密连锁，遗传连锁距离为2.66cM。